Analysis of features gene polymorphism ABCB4 by NGS sequencing method in women of reproductive age with cholelithiasis

Cover Page

Abstract


Analysis of ABCB4 gene in young women with cholelithiasis and relative story of gallstone disease was performed by NGS sequencing. The discovered “risk alleles” of this gene and their adverse haplotypes testify to ABCB4 participation in the development of cholelithiasis.

Введение Желчнокаменная болезнь (ЖКБ, холелитиаз) - заболевание гепатобилиарной системы, обусловленное нарушением обмена холестерина и/или билирубина, характеризуется образованием камней в желчном пузыре и/или в желчных протоках с возможным развитием опасных осложнений [1, 7]. ЖКБ является широко распространенным заболеванием с постоянным ростом частоты встречаемости в популяции. По данным обширных эпидемиологических исследований, проведенных в последние годы, частота ЖКБ в развитых странах составляет 10-15 % среди взрослого населения [9]. В целом по России данное заболевание выявляется у 13-20 % населения [4]. Хрестоматийным фактором риска развития ЖКБ является женский пол [17]. Соотношение женщин, страдающих данным заболеванием, к мужчинам варьирует от 8:1 до 2:1 [8]. ЖКБ - полиэтиологическое заболевание. Среди факторов развития патологии желчевыводящей системы, помимо пола, присутствуют такие, как нарушение диеты, курение, применение комбинированных оральных контрацептивов (КОК), число беременностей, использование вспомогательных методов оплодотворения, а также наследственный компонент [12, 17]. В последние годы генетический аспект возникновения данного заболевания активно изучается. Показано, что частота развития калькулезного холецистита среди родственников больных ЖКБ составляет 8,5 % против 2,2 % в популяции [2, 6]. В Швеции на 43 156 пар близнецов встречаемость холелитиаза составила 25 % при наличии наследственного фактора [18]. Наше исследование сфокусировано на гене ABCB4, кодирующим мембрано-ассоциированный белок. Последний является членом суперсемейства АТФ-связанных транспортеров (ATP-binding cassette (ABC)), которые способны переносить различные молекулы через экстра- и внутриклеточные мембраны. ABC гены включают 7 различных подсемейств: ABC1, MDR/TAP, MRP, ALD, OABP, GCN20, White. Ген ABCB4 является членом подсемейства MDR/TAP, определяющим мультилекарственную устойчивость и презентацию антигена [5,7,13]. Это липидный транспортёр, переносящий фосфатидилхолин с внутренней на внешнюю поверхность канальцевой мембраны гепатоцита с последующей экстракцией желчными солями в просвете канальца. Основная функция желчного фосфолипида состоит в защите мембран клеток, выстилающих желчное дерево, от желчных солей [16]. Рядом авторов предложен гипотетический механизм экскреции канальцевого липида (рис. 1). Процесс начинается с экскреции желчных солей посредством ABCB11 (выносящая помпа желчных солей), что приводит к повышению их концентрации. ABCB4 переносит фосфатидилхолин с внутренней на внешнюю поверхности канальцевой мембраны таким образом, что последний может быть захвачен желчными солями с формированием смешанного соединения. Данное соединение может связывать холестерол, доставленный с помощью ABCG5/8 (транспортер стеролов). ATP8B1 транспортирует аминофосфолипид с внутренней на внешнюю поверхность канальцевой мембраны, тем самым усиливая соединение сфингомиелина и холестерола, что в свою очередь обеспечивает устойчивость мембран против желчных солей. Мутации в гене ABCB4 нарушают транспорт фосфатидилхолина, что в конечном счете ведет к формированию холестериновых камней в желчи. На сегодняшний день выявлены несколько ключевых вариантов в гене ABCB4, ассоциированных с высоким риском развития ЖКБ. Одним из наиболее перспективных методов исследования данных генетических маркеров является метод секвенирования ДНК нового поколения (NGS - New Generation Sequencing) [3, 15, 21, 22]. Цель настоящей работы - сравнительный молекулярно-генетический анализ первичной нуклеотидной последовательности гена ABCB4 у больных ЖКБ методом секвенирования ДНК нового поколения (NGS - New Generation Sequencing). Материалы и методы Формирование групп: Учитывая роль наследственного компонента в развитии ЖКБ (наличие заболевания у родителей, бабушек и т. п.) были отобраны 18 женщин в возрасте от 22 до 35 лет с инструментально доказанным (методом УЗИ) холестазом. У всех пациенток был собран подробный анамнез, выполнены лабораторные и инструментальные методы исследования, проведено лечение. Забор образцов крови осуществлялся в клинике общей хирургии СПбГМУ имени академика И. П. Павлова с последующим анализом в лаборатории пренатальной диагностики ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д. О. Отта», г. Санкт-Петербург. От каждой женщины было получено информированное согласие. Экстракция ДНК. На первом этапе было выполнено выделение ДНК из лимфоцитов венозной крови в соответствии с методикой, приведенной в руководстве Сэмбрука (Sambrook et al., 1989), с некоторыми модификациями. Амплификация последовательности гена ABCB4. В дальнейшем с целью проведения амплификации нуклеотидная последовательность гена ABCB4 была условно разделена на 10 фрагментов, длинной от 5368 до 9021 п. о. Амплификацию проводили с использованием 10 пар праймеров (табл. 1). Выбор последовательностей праймеров осуществляли с помощью программы “Oligo 6” (США) и “NCBI BLAST” (США) с учетом рекомендаций производителя фермента амплификации - «удлиняющей» полимеразы («Roche», Швейцария). Реакционная смесь для амплификации объемом 50 мкл включала: 3-5 мкл ДНК-матрицы (70-100 нг/мкл), к которой добавляли деионизованную воду, 5 мкл буфера и 0,75 мкл фермента, рекомендованных производителем («Roche», Швейцария), 300 нМ каждого праймера, 300 мМ каждого dNTP («Roche», Швейцария). Для амплификации использовали программируемый термоциклер 2720 фирмы «Applied Biosystem» (США). После предварительной денатурации ДНК (3 минуты при 94 °С) проводили амплификацию в режиме: - 10 циклов: 94 °С (25 сек), 55 °С (15 сек), 68 °С (11 мин); и 25 циклов: 94 °С (25 сек), 55 °С (15 сек), 68 °С (11 мин с удлинением за цикл на 20 сек), 72 °С (11 мин) - для фрагментов № 1, 2, 5; - 10 циклов: 94 °С (25 сек), 63 °С (15 сек), 68 °С (11 мин); и 25 циклов: 94 °С (25 сек), 63 °С (15 сек), 68 °С (11 мин с удлинением за цикл на 20 сек), 72 °С (11 мин) - для фрагментов № 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10. Наличие ПЦР-продуктов, необходимых для секвенирования, анализировали в 0,8%-м агарозном геле. Измерение концентрации ДНК с помощью прибора «Qubit». Концентрацию ПЦР-продуктов гена ABCB4 измеряли с помощью прибора «Qubit» («Invitrogen», США), используя набор реагентов «dsDNA BR Assay Kits» («Invitrogen», США), согласно протоколу фирмы-производителя. ПЦР-продукты, соответствующие каждому образцу, смешивали пропорционально концентрациям. В исследование брали от 50 до 100 нг смеси ПЦР-продуктов. Анализ образцов на геномном секвенаторе «Ion Torrent». Для дальнейшего анализа на геномном секвенаторе были выбраны фрагменты № 4, 5, 6, 9 в связи с тем, что большая часть описанных в литературе SNP-ассоциированных с развитием ЖКБ, локализованы именно в данных фрагментах гена ABCB4 [11, 14]. Для подготовки 18 библиотек использовали набор реагентов «Ion Xpress™ Plus Fragment Library Kit» («Life technologies», США) и необходимое дополнительное оборудование, расходные материалы и реактивы согласно прилагающийся инструкции. Молярную концентрацию баркодированных библиотек определяли с помощью прибора «2200 TapeStation Instrument» («Agilent technologies», США), используя чипы «High Sensitivity D1K ScreenTape» и реактивы фирмы «High Sensitivity D1K Reagents». Проведение эмульсионной ПЦР и «обогащение» микросфер проводили согласно инструкции к набору реагентов «Ion OneTouch™ 200 Template Kit v2 DL» («Life technologies», США). Реакцию секвенирования проводили, используя набор реагентов «Ion PGM™ Sequencing 300 Kit» («Life technologies», США) и микрочип «Ion 314™ Chip» («Life technologies», США). Запуск прибора, его последующую «чистку» и эксплуатацию осуществляли согласно руководству к эксплуатации «Ion Personal Genome Machine® System» и соответствующим инструкциям: «Ion PGM™ Sequencing 300 Kit», «Torrent Suite 3.4.1» («Life technologies», США). Обработка полученных данных. Анализ полученных данных был проведен путем выравнивания нуклеотидных последовательностей против референсного генома hg19 (Genome Reference Consortium GRCh37) (Lander et al., 2001), в результате чего были получены файлы в формате BAM. Предварительную обработку результатов секвенирования проводили, используя программу для анализа нуклеотидных последовательностей - «UGENE» (Okonechnikov et al., 2012) и базу данных Ensembl. Аннотирование и фильтрацию вариантов осуществляли с помощью интернет-ресурса «Gene-Talk». Методы статистической обработки. Для сравнения исследуемых подгрупп по частотам генотипов использовали точный тест Фишера. Для анализа корреляции между генотипами и параметрами вычисляли линейный коэффициент корреляции (Пирсона). Расчеты проводили в среде для статистических вычислений R (http://www.R-project.org/) c помощью программы «R Cloud Workbench» (Goncalves et al., 2011). Результаты и обсуждение Для изучения генетических маркеров ЖКБ у беременных впервые в России применен новый подход - метод полногеномного секвенирования. В качестве платформ для секвенирования использовали прибор «Ion Torrent» фирмы «Life Technologies», основным достоинством которого является возможность быстрого секвенирования протяженных фрагментов ДНК, что позволяет проводить последующий биоинформационный анализ в автоматическом режиме без использования сложной и дорогостоящей компьютерной инфраструктуры. Исследованные фрагменты гена ABCB4 были секвенированы в среднем с более, чем 30-кратным покрытием. Суммарно во всех 18 образцах было выявлено 65 однонуклеотидных вариаций - (SNP), которые согласно международной номенклатуре обозначают как rs (reference site) с указанием соответствующего порядкового номера. На следующем этапе работы была проведена аннотация и фильтрация полученных данных. Анализ данных проводили с использованием свободных интернет ресурсов, аккумулирующих информацию о научных и клинических значимых ассоциациях. С этой целью был использован портал «Gene-Talk» (http://www.gene-talk.de). Ресурс позволяет отфильтровывать данные по разным критериям, одним из которых является научная и клиническая значимость выявленного генетического маркера. Максимальной научной и медицинской значимостью, согласно данному порталу, обладали 5 из 65 выявленных вариантов (rs31658, rs1149222, rs2109505, rs31672, rs1202283). Наличие этих вариантов было подтверждено в «ручном режиме» - с помощью программы «UGENE» (Okonechnikov et al., 2012) [19]. Необходимо отметить, что выявленные «значимые» варианты соответствуют ранее известным маркерам заболеваний гепатобиллиарной системы [11, 14, 10]. При этом среди 18 обследованных у 5 пациенток выявлено наличие 2 вариантов SNP с «высокой медицинской и научной значимостью», у 10 - 3 и у 3 - 4 вариантов функционально значимых SNP. Этот факт позволяет предполагать, что каждая из пациенток с ЖКБ имеет как минимум два «мутантных» аллеля («аллеля риска») гена ABCB4, предрасполагающих к развитию заболевания печени [20]. Для дальнейшего анализа полученных данных для каждого из 3 выявленных SNP rs31658, rs1149222, rs31672 были составлены 8 гаплотипов, учитывающих все возможные сочетания аллелей этих трех SNP (табл. 2) (Yuki Ohishi et al., 2008). Конечно, при такой малочисленности аллелей и их возможных сочетаний обнаружить статистически значимые отличия сложно, но тем не менее при сравнении полученных результатов с клиническими данными некоторые закономерности удается проследить. У половины пациенток заболевание протекало с осложнениями: у 5 (28 %) - с холедохолитиазом, у 1 (5 %) - с желчной коликой, у 1 (5 %) - острый холецистит, у 1 (5 %) - эмпиема желчного пузыря, у 1 (5 %) - развился гепатоз беременных. Четкой связи клинических проявлений с распределением по гаплотипам не прослеживается, однако следует отметить, что у всех пациенток с гаплотипом Hap5/Hap3 заболевание всегда носило выраженный хронический характер. Такой клинический признак, как боль, был характерен для большинства женщин (15 человек - 83 %), и частота болевых приступов распределялась примерно равномерно. В 3 случаях (17 %) - приступы были частыми (раз в неделю/месяц), в 6 (33 %) - раз в полгода, а у остальных 6 пациенток (33 %) - приступы были редкими (раз в год). Показатели лабораторных и ультразвуковых исследований полностью соответствовали поставленным диагнозам и характеру течения заболевания, и выделить особенности в этой области не представляется возможным. Все пациентки получили лечение: либо консервативное с положительным эффектом, либо оперативное (в 5 случаях с холедохолитиазом - эндоскопическая папиллосфинктеротомия, а также в 5 случаях - лапароскопическая холецистэктомия). Большинство обследованных пациенток имели ранее упомянутые факторы риска развития ЖКБ: курение - в 11 случаях (61 %), несоблюдение режима и качества питания - в 12 случаях (67 %), прием КОК (комбинированных оральных контрацептивов) - в 12 случаях (67 %). ИМТ (индекс массы тела) у пациенток в основном составил норму (20-25 кг/см2) - в 12 случаях (67 %), и только у 6 превысил с минимальным значением 27 кг/см2 и с максимальным - 48 кг/см2 в одном случае. В репродуктивном здоровье исследуемых женщин также прослеживаются факторы риска развития ЖКБ. Так у 10 пациенток (56 %) имели место более двух беременностей, из которых у 4 пациенток (22 %) завершились рождением двойни. Примечательно, что у 5 женщин заболевание впервые проявило себя во время беременности (от 11-й до 32-й недели), у одной - на 3-м месяце грудного кормления. В свою очередь, и холелитиаз оказал своё влияние на течение беременности: у 7 пациенток (64 %) отмечались такие осложнения, как гестоз (4), угроза невынашивания беременности (3) и гепатоз беременных (1). В семейном анамнезе женщины с ЖКБ чаще указывали на наличие этого заболевания у матерей (в 13 случаях - 72 %). Примечательно, что при наличии гаплотипов Hap3/Hap3 и Hap5/Hap3 распространенность холестаза в семье больше и чаще затрагивала матерей, бабушек и сестер пациентов (по 2 случая при каждом гаплотипе). В одном случае при наличии гаплотипа Hap3/Hap7 заболевание было установлено в раннем возрасте как у матери (25 лет), так и у самой пациентки (22 года). Обращает так же на себя внимание более раннее выявление ЖКБ (до 25 лет): у 1 пациентки - с 12 лет (Hap5/Hap6), у 2 - с 18 лет (Hap1/Hap1, Hap8/Hap8), у 7 - с 21 до 24 лет (Hap3/Hap7, Hap5/Hap3). Заключение Ассоциация определенных гаплотипов 3 проанализированных полиморфных сайтов гена ABCB4 с наличием ЖКБ и его клиническими проявлениями прослеживается не во всех случаях. Это в значительной мере объясняется малым числом больных с ЖКБ в опыте и отсутствием контрольной группы. Последнее отчасти связано с большой сложностью эксперимента и его высокой стоимостью. Вместе с тем полученные результаты подтверждают участие гена ABCB4 в развитии ЖКБ у женщин репродуктивного возраста. Выявленные нами «аллели риска» этого гена и их неблагоприятные гаплотипы во всех образцах ДНК у больных с ЖКБ свидетельствуют в пользу такого предположения. Необходимы дальнейшие исследования на большем числе полиморфных сайтов гена ABCB4 с целью уточнения гаплотипов риска ЖКБ. Исследование должно быть дополнено обязательным сравнением полученных результатов с таковыми в контрольной группе здоровых индивидуумов того же пола и возраста.

Aglaia Nikolaevna Ailamazyan

First St. Petersburg State Medical University named after Pavlov I. P

Email: iagmail@ott.ru
PhD student.

D U Semenov

First St. Petersburg State Medical University named after Pavlov I. P

Email: iagmail@ott.ru

Vladimir Semenovich Pakin

D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS

Email: iagmail@ott.ru
intern department of pathology of pregnancy

M M Danilova

D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS

Email: iagmail@ott.ru

Andrey Sergeevich Glotov

D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS

Email: selkovsa@mail.ru
candidate of biological scientist, scientist, lab. of prenatal diagnosis of congenital and inherited diseases

Vladislav Sergeevich Baranov

D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS

Email: iagmail@ott.ru
Corresponding Member of Russian Academy Sciences Chief Lab. for prenatal diagnosis of inherited and inborn disorders

  1. Аснер Т. В. Желчнокаменная болезнь: распространенность, социальная значимость и качество жизни больных. Жёлчнокаменная болезнь: тез. докл. Иркутск; 2006: 6-10.
  2. Баранов В. С. Генетический паспорт - основа индивидуальной и предиктивной медицины. СПБ.: Изд-во Н-Л; 2009.
  3. Булыгина Е. С., Велихов В. Е., Горанская Д. А., Груздева Н. М., Заридзе Д. Г., Ковальчук М. В., Мазур А. М., Матвеев В. Б., Недолужко А. В., Прохорчук Е. Б., Расторгуев С. М., Скрябин К. Г., Теслюк А. Б., Цыганкова С. В., Чеканов Н. Н. Комбинирование двух технологических платформ для полногеномного секвенирования человека. Acta Naturae. 2009; №. 3: 26-32.
  4. Бурагина Т. А., Дичева Д. Т., Маев И. В. Диагностика и лечение билиарного сладжа у больных язвенной болезнью. Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 2007; № 4: 68-72.
  5. Григорьева И. Н. Основные факторы риска желчнокаменной болезни. Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии. 2007; № 6: 17-21.
  6. Евсеева И. В. Установление в условиях поликлиники риска развития холецистита. Терапевтический архив. 1994; Т. 66, № 1: 67-70.
  7. Екимова Н. В., Лифшиц В. Б., Субботина В. Г. К этиопатогенезу желчнокаменной болезни и холестероза желчного пузыря. Saratov Journal of Medical Scientific Research. - 2009. Vol.5. № 3: 34-8.
  8. Иванченкова P. A. Хронические заболевания желчевыводящих путей. М.: Атмосфера; 2006: 416.
  9. Ильченко А. А. Классификация желчно-каменной болезни. Терапевтический Архив. 2004; № 2: 75-8.
  10. Acalovschi M., Chiorean E., Grunhage F., Krawczyk M., Lammert F., Tirziu S. Common variants of ABCB4 and ABCB11 and plasma lipid levels: a study in sib pairs with gallstones, and controls. Lipids. 2009;44 (6): 521-6.
  11. Aiba Y., Higa S., Iio N., Inayoshi M., Ishibashi H., Komori A., Nakamura M., Ohishi Y., Omagari K., Tsukamoto K. Single-nucleotide polymorphism analysis of the multidrug resistance protein 3 gene for the detection of clinical progression in Japanese patients with primary biliary cirrhosis. Hepatology. 2008; 48 (3):853-62.
  12. Berenguer J., Borghol A., Caldenty M., Devesa F., Ferrando J., Moncho J., Moreno M. J., Nolasco A. Cholelithiasic Disease and Associated Factors in a Spanish Population. Digestive Diseases and Sciences. 2001; Vol.46, No.7: 1424-36.
  13. Bronskyi J., Hrebicek M., Jirsa M., Nevoral J. Role of common canalicular transporter gene variations in aetiology of idiopathic gallstones in childhood. Folia Biologica. 2010; Vol.56: 9-13.
  14. Buckley R., Chambers J., Ch'ng C., Cooley S., Dixon P., Donnelly J., Geenes V., Geary M., Glantz A., Jarvis S., Khan S., Kubitz R., Lammert F., Mannino R., Marschall H., Nicolaides K., Sothinathan M., Syngelaki APaul P., Tribe R., Wadsworth C., Whittaker J., Williamson C. A comprehensive analysis of common genetic variation around six candidate loci for intrahepatic cholestasis of pregnancy. American Journal of Gastroenterology. 2014; 109 (1):76-84.
  15. Chang X., Wang K. wANNOVAR: annotating genetic variants for personal genomes via the web. Journal of Medical Genetics. 2012; Vol. 49, № 7: 433-6.
  16. Coen C. Paulusma, Oude Elferink, Ronald P. J. Function and pathophysiological importance of ABCB4 (MDR3 P-glycoprotein). Eur J Physiol. 2007; Vol.453: 601-10.
  17. Diehl A. K. Epidemiology and natural history of gallstone disease. Gastroenterol Clin North Am. 1991; Vol.20, N.1: 1-19.
  18. Einarsson C., Grjibovski A., Katsika D., Lammert F., Lichtenstein P., Marschall H.-U. Genetic and environmental influences on symptomatic gallstone disease: a swedish study of 43,141 twin pairs. Hepatology. 2005; Vol. 41, N. 5: 1138-43.
  19. Fursov M., Okonechnikov K., Golosova O., UGENE team. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit. Bioinformatics. 2012; Vol.28, №. 8: 1166-7.
  20. Garrison E., Marth G. Haplotype-based variant detection from short-read sequencing. Available at: http://arxiv.org/abs/1207.3907. (accessed: 15.12.2013).
  21. Lander E. S. The Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 2001; Vol. 409, № 6822: 860-921.
  22. Liu L., Li Y., Li S. Comparison of next-generation sequencing systems. Journal Of Biomedicine And Biotechnology. 2012; Vol. 2012, Article ID 251364: 11.

Views

Abstract - 319

PDF (Russian) - 285

Cited-By


PlumX


Copyright (c) 2014 Ailamazyan A.N., Semenov D.U., Pakin V.S., Danilova M.M., Glotov A.S., Baranov V.S.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.