Expected applications of the endometrial stem cells in clinical practice

Full Text

Ограниченный регенеративный потенциал большинства органов и тканей организма человека нередко снижает эффективность современных медикаментозных методов реабилитации. Первый опыт внедрения клеточных продуктов в клиническую практику подтвердил возможность новых физиологически обоснованных подходов к терапии многих заболеваний, в том числе плохо поддающихся коррекции традиционными методами лечения [7, 17, 39, 44, 62]. Клеточные технологии в большинстве своем основаны на использовании стволовых клеток - недифференцированных клеток-предшественниц, способных развиваться при определенных условиях в клетки практически любых тканей взрослого организма [60]. Список показаний для клеточной терапии неуклонно расширяется, совершенствуются методы выделения, культивирования и клинического применения стволовых клеток. Так, трансплантация стволовых клеток костного мозга является повсеместной в гематологической практике [2, 57]. В травматологии и ортопедии мезенхимальные стволовые клетки используются для улучшения остеогенеза при небольших костных дефектах и даже для замещения обширных объемов утраченной костной и хрящевой ткани [26, 72]. Имеются данные о положительных результатах использования стволовых клеток для лечения ожогов роговицы [9] и кожи [25]. Регионарное введение стволовых клеток эффективно при некоторых хронических заболеваниях печени [32, 64]. В настоящее время активно разрабатываются подходы к терапевтическому использованию стволовых клеток в отношении инсультов, инфарктов сердечной мышцы, ишемических повреждений конечностей [16, 28, 38, 45, 61]. Большие надежды связаны с результатами клинических исследований по применению клеточных технологий в терапии ряда нейродегенеративных заболеваний: бокового амиотрофического склероза, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера [46, 58, 67]. Проблема сахарного диабета также не осталась без внимания исследователей, занимающихся поиском практических целенаправленных приложений для клеточных культур. На сегодняшний день существует уже несколько подходов к замещению эндокринной функции поджелудочной железы с использованием стволовых клеток [8, 31, 36]. Развитию клеточных технологий способствуют не только достижения в области клеточной биологии и клеточной инженерии, но и постоянно совершенствующаяся законодательная база. В Японии, Германии, Великобритании и США правовое регулирование направлений развития клеточных технологий берет свое начало с 2001 г. Жесткие законодательные рамки с многочисленными запретами в отношении источников стволовых клеток постепенно стали рассматриваться как ограничивающие развитие передовых технологий в медицине [30]. В настоящее время в вышеуказанных странах не существует юридического запрета на использование стволовых клеток любого происхождения для создания клеточных продуктов [11]. Разработчики клеточных продуктов имеют право и на проведение клинических исследований [41]. По данным национального реестра клинических исследований США, на сегодняшний день, зарегистрировано более 5 тысяч клинических исследований с использованием стволовых клеток. В Японии, кроме всего прочего, существует процедура ускоренного введения клеточных технологий в клиническую практику - при положительных результатах уже на II фазе клинических испытаний [53]. В России с 2013 г. зарегистрирован проект федерального закона «Об обращении биомедицинских клеточных продуктов», регламентирующий доклинические исследования и государственную регистрацию клеточных продуктов, а также организацию и проведение клинических исследований биомедицинских клеточных продуктов. Данный законопроект для изготовления клеточных продуктов разрешает использование только клеток человека (а именно соматических стволовых клеток, к которым относятся и эндометриальные стволовые клетки). Стволовые клетки по своему происхождению делятся на эмбриональные и соматические. Эмбриональные стволовые клетки способны развиваться в клетки - производные любого зародышевого листка. По пролиферативным характеристикам эмбриональные стволовые клетки превосходят любые другие [70, 73]. Недостатками их являются генетическая нестабильность, что с позиции практического применения означает потенциальную онкогенность [3]. Соматические стволовые клетки обнаруживаются во всех тканях взрослого организма [42], они могут дифференцироваться в разные клетки в пределах одного зародышевого листка [60]. Преимуществами соматических стволовых клеток являются доступные источники их получения, меньший онкогенный потенциал, возможность аутодонорства [50, 73]. Возрастающие объемы исследовательских работ с использованием клеточных технологий обусловливают необходимость поиска новых источников стволовых клеток. Несмотря на то что соматические стволовые клетки обнаружены в большинстве тканей организма взрослого человека [42], далеко не каждую из них можно использовать в качестве источника стволовых клеток. Получение стволовых клеток зачастую связано с рядом неудобств для донора. Так, все современные методы получения стволовых клеток из организма взрослого человека основаны на инвазивных вмешательствах. При этом ограниченное содержание стволовых клеток в тканях диктует необходимость проведения повторных процедур и/или применения стимулирующей терапии [4, 50]. Среди факторов риска осложнений для донора следует отметить также и высокую медикализацию процедуры забора стволовых клеток [4]. В то же время возможность использования отторгающегося в физиологических условиях эндометрия в качестве источника соматических стволовых клеток позволяет оградить донора от операционной, лекарственной и этической травмы. Первые данные о присутствии в эндометрии клеток со свойствами стволовых были получены в 2004 г. В изолированных обогащенных культурах эпителиальных и стромальных клеток эндометрия были обнаружены отдельные клетки, способные образовывать клеточные колонии [10]. Высокий пролиферативный потенциал и способность к самообновлению клеток этих колоний послужили основанием для дальнейшего изучения этих клеточных популяций. Было показано, что клетки из колоний стромального происхождения являются мультипотентными и при культивировании в индукционных средах могут дифференцироваться в адипоциты, хондробласты, миоциты и остеобласты. А клетки из колоний эпителиального происхождения могут при дальнейшем культивировании формировать железоподобные структуры [13]. Таким образом было доказано присутствие в эндометрии клеток со свойствами стволовых [22]. Клетки-предшественницы, обнаруживаемые в эндометрии, гетерогенны по своей биологии: это и эпителиальные прогениторные клетки, и эндотелиальные прогениторные клетки, и мезенхимальные стволовые клетки [21]. Основной задачей стволовых клеток эндометрия является восстановление ткани эндометрия, поврежденного в результате циклической десквамации или под действием какого-либо фактора. Так называемые резидентные эпителиальные прогениторные клетки локализуются в области дна желез в базальном слое эндометрия и дают начало клеточной выстилке желез и эпителию эндометрия [23]. Восстановление клеточного состава стромы происходит за счет мезенхимальных стволовых клеток, нишей которым являются периваскулярные пространства базального слоя эндометрия [23]. Описаны и альтернативные пути регенерации эндометрия. Так, R. Garry и др., используя гистероскопию, гистологическое исследование и электронную микроскопию образцов эндометрия, продемонстрировали, что восстановление эпителиального компонента слизистой матки происходит за счет дифференцировки клеток стромы [24]. Существует теория о восстановлении эндометрия из сохранившихся неоторгнутых участков функционального слоя, находящихся в поздносекреторной фазе [24]. Прогениторные клетки слущенного функционального слоя также могут вносить вклад в восстановление эндометрия путем обратной имплантации к новосформированному функциональному слою [24]. Кроме эндометриальных стволовых клеток в процессе регенерации эндометрия участвуют и стволовые клетки экстрагенитального происхождения. В ткань эндометрия из кровотока в небольшом количестве рекрутируются гемопоэтические стволовые клетки костномозгового происхождения, миелоидные клетки и эндотелиальные прогениторные клетки [6, 15, 19]. Сигналом для миграции служат различные провоспалительные факторы, в избытке синтезирующиеся в очаге повреждения [23]. В локусе повреждения эти клетки дифференцируются до клеток эндометриального эпителия, стромы и эндотелиальных клеток [14, 35, 63]. Стволовые клетки эндометрия обладают высоким пролиферативным потенциалом - одна клетка может воспроизвести до 6 × 1011 копий [68]. Клоногенность стволовых клеток стромы и эпителиального компонента эндометрия не меняется на протяжении менструального цикла, а также не зависит от гормональной активности эндометрия [55]. Чрезвычайно важно подчеркнуть способность стволовых клеток эндометрия сохранять генетическую стабильность после 40 пассажей, что свидетельствует об их низкой онкогенности [68]. Под действием специфического окружения in vivo или in vitro в среде, обогащенной факторами роста, эндометриальные стволовые клетки проявляют свою мультипотентность - дифференцируются в мио-, адипо-, остео- или хондрогенном направлениях [20, 40]. Среди других соматических стволовых клеток эндометриальные отличаются определенной иммунной привилегированностью. Так, в аллогенной культуре мононуклеаров периферической крови стволовые клетки менструальной крови показывают умеренно слабый иммунный ответ в смешанной лимфоцитарной реакции [68]. Это свойство позволяет изучать эндометриальные стволовые клетки в качестве алло- или ксенотрансплантата без учета иммунологического ответа организма [12]. Все прогениторные клетки, обнаруживаемые в эндометрии, экспрессируют факторы плюрипотентности, - Sox-2, Oct-4 и Nanog [68]. Также в культуре стволовых клеток эндометриального происхождения обнаруживаются маркеры, обычно используемые для детекции стволовых клеток костномозгового происхождения - CD9, CD13, CD14, CD29, CD31, CD44, CD73, CD90, CD105, CD117, CD133, CD146 [13]. G-белок-сопряженный рецептор-49 (GPR49, известный и как Lgr-5) обнаруживается в эпителиальных прогениторных клетках эндометрия и в клетках стромы [43]. В качестве специфического маркера стволовых клеток эндометрия может использоваться коэкспрессия двух периваскулярных факторов CD140b и CD146 [56]. Другим специфическим маркером мезенхимальных стволовых клеток эндометрия является сочетание рецептора ß к тромбоцитарному фактору роста (PDGF-Rß) и поверхностной молекулы CD146 [56]. Клетки, несущие на своей поверхностной мембране данное сочетание молекул, являются мультипотентными, дифференцируются в разных направлениях в пределах мезодермального листка (остео-, хондро-, миогенном). Более подробное изучение клеток с данным сочетанием маркеров привело к открытию другого специфического, но при этом самодостаточного маркера - молекулы W5C5 [48]. Мезенхимальные стволовые клетки эндометриального происхождения экспрессируют на своей поверхности молекулы главного комплекса гистосовместимости (MHC) первого класса и не экспрессируют молекулы второго класса МНС, что дает им низкую иммуногенность и наделяет иммуномоделирующими свойствами [51]. Эндометриальные стволовые клетки можно получить несколькими способами. Их можно выделить из ткани эндометрия, полученной в ходе любой внутриматочной процедуры: инструментального удаления или вакуум-аспирации, штрих-биопсии или биопсии с использованием урогенитального зонда типа Пайпель [1]. Столовые клетки обнаруживаются в образцах эндометрия женщин не только репродуктивного возраста, но и в состоянии постменопаузы [66]. В 2007 г. стволовые клетки эндометрия были выделены непосредственно из менструальной крови [29, 49, 54]. Стволовые клетки, полученные из менструальной крови, проявляют свойства мезенхимальных стволовых клеток, т. е. это клетки стромального происхождения. Эпителиальные прогениторные клетки не обнаруживаются в менструальной крови или обнаруживаются в несравненно меньшем количестве [52]. Объяснением этому факту служат различия в локализации обсуждаемых клеток-предшественниц: мезенхимальные стволовые клетки обнаруживаются и в базальном, и в функциональном слоях эндометрия и, соответственно, отторгаются во время менструации в составе функционального слоя. Резидентные прогениторные клетки, дающие начало эпителиальному ростку, локализуются в железах базального слоя эндометрия, и в норме в менструальной ткани не должны присутствовать. В настоящее время имеется опыт использования эндометриальных стволовых клеток в нескольких преклинических исследованиях, а также на животных моделях различных индуцированных патологических состояний. Регенеративный потенциал эндометриальных стволовых клеток впервые был доказан на экспериментальной модели миодистрофии Дюшена у иммунодефицитных мышей. Трансплантация стволовых клеток в толщу пораженных мышц способствовала восстановлению структуры и функции мышцы [12]. Несмотря на то что механизм действия стволовых клеток еще нуждался в объективных доказательствах, полученный эффект авторы связали с дифференцировкой стволовых клеток in situ и стимуляцией ангиогенеза. Стимуляция ангиогенеза как основа терапевтического потенциала эндометриальных стволовых клеток была также обозначена на экспериментально моделированных состояниях инфаркта миокарда [29] и критической ишемии конечности [51]. Интересно, что в условиях чрезмерной, тумор-ассоциированной активации ангиогенеза эндометриальные стволовые клетки, напротив, проявляют способность угнетать рост сосудов. Это свойство эндометриальных стволовых клеток было наглядно продемонстрировано на мышиной модели интракраниальной глиомы. Введенная внутривенно суспензия эндометриальных стволовых клеток способствовала двукратному уменьшению опухоли за счет антиангиогенной активности [27]. Существует и ряд работ, описывающих в качестве основного механизма лечебного действия эндометриальных стволовых клеток их способность к дифференцировке. N. Hida и др. показали способность стволовых клеток эндометриального происхождения к дифференцировке в клетки сердечной мышцы не только in vitro, но и in vivo на крысиной модели инфаркта миокарда [29]. В другом исследовании эндометриальные стволовые клетки человека после интракраниального (в полосатое тело) введения мышам с моделированной болезнью Паркинсона дифференцировались in vivo в нейроны, способные синтезировать допамин [71]. В работах H. Y. Li и др. недифференцированные мезенхимальные стволовые клетки эндометриального происхождения после культивирования в индукционных средах с основными факторами роста развивались в клетки, способные к синтезу in vitro инсулина и глюкагона. После трансплантации этих дифференцированных клеток под капсулу почки иммунодефицитной мыши с моделированным сахарным диабетом происходила стабилизация показателей гликемии животного [47]. Терапевтический потенциал стволовых клеток эндометриального происхождения реализуется также посредством паракринных влияний. В работе Z. Jiang и др. эндометриальные стволовые клетки вводились в мышцу сердца крысы через 30 минут после лигирования коронарной артерии. Подобная терапия стволовыми клетками вела к сохранению жизнеспособности миокарда в зоне инфаркта и улучшению функции сердца. Однако авторам не удалось доказать дифференцировку стволовых клеток в клетки сердечной мышцы или сосудов. Считается, что полученный терапевтический эффект обеспечивают синтезируемыми стволовыми клетками цитокины и факторы роста, которые через активацию киназного каскада предотвращают некроз и тормозят программируемую клеточную гибель [37]. О применении эндометриальных стволовых клеток в терапии заболеваний человека впервые было доложено в 2009 г. В первую фазу клинического исследования вошли 4 человека с рассеянным склерозом. Аллогенные стволовые клетки, полученные из менструальной крови, вводились внутривенно и интратекально дробно по фиксированной схеме. Последующее наблюдение за пациентами не выявило каких-либо осложнений или побочных реакций. Несмотря на то что клиническое состояние пациентов не улучшилось, ухудшения течения основного заболевания также не было зафиксировано [74]. В другом проспективном исследовании пациентам с миодистрофией Дюшена мезенхимальные стволовые клетки эндометриального происхождения вводили внутримышечно. На протяжении трех лет наблюдения побочных реакций выявлено не было. Исследователи отметили увеличение мышечной силы и уменьшение частоты инфекционных осложнений у пациентов, перенесших имплантацию [33]. Стволовые клетки эндометриального происхождения также использовались в комбинированной терапии хронической сердечной недостаточности. Через год после внутривенного введения суспензии стволовых клеток было отмечено улучшение ряда показателей сердечной деятельности, а также улучшение качества жизни пациента [34]. Эти данные явились обоснованием для организации второй фазы клинического исследования с вовлечением 60 пациентов [5]. Терапия стволовыми клетками эндометриального происхождения не ограничивается использованием клеточной суспензии. Все имеющиеся современные разработки в области клеточных технологий можно с успехом применять по отношению к эндометриальным стволовым клеткам. Особо актуальным направлением в настоящее время является разработка матриц и разного рода каркасов. Для терапии пролапса гениталий были разработаны тканеинженерные сетки, колонизированные эндометриальными стволовыми клетками. Конструкции были апробированы на кожных ранах животных [18]. Стволовые клетки в составе сеток стимулировали неоангиогенез, интенсифицировали регенерацию тканей, уменьшали проявления воспаления. Также было отмечено, что присутствие эндометриальных стволовых клеток в имплантированных сетках уменьшало реакцию отторжения импланта и ускоряло процесс интеграции сетчатого протеза. В другом исследовании для реконструкции стенки мочевого пузыря использовалась биоабсорбируемая полимерная матрица, колонизированная эндометриальными стволовыми клетками [59]. В данной работе было показано, что клетки, находящиеся в гидрогеле матрицы, способны дифференцироваться в миоциты и совместно с матрицей замещать дефекты стенки мочевого пузыря. Стволовые клетки эндометрия в своем естественном микроокружении обеспечивают не только структурное, но и полное функциональное восстановление слизистой оболочки матки после ежемесячной ее десквамации. Такие свойства, как высокий пролиферативный потенциал, низкий туморогенный потенциал, противовоспалительная активность и определенная иммунопривелигированность, способствуют их активному всестороннему изучению и использованию в качестве терапевтического агента при различных патологических состояниях. А отсутствие необходимости проведения стимулирующей терапии и инвазивных вмешательств для получения богатого стволовыми клетками эндометрия позволяют рассматривать его не только в качестве альтернативного источника соматических стволовых клеток, но и с позиций перспектив аутодонорства и банкинга стволовых клеток.

About the authors

Elena Olegovna Usoltceva

St. Petersburg State University

Email: usolceva.elena@inbox.ru
MD, Department of Obstetrics, Gynecology and Reproductology, Medical Faculty

Alexander Mkrtichevich Gzgzyan

St. Petersburg State University

Email: agzgzyan@hotmail.com
MD, Professor of the Department of Obstetrics, Gynecology and Reproduction, Medical Faculty

Liailia Kharryasovna Dzhemlikhanova

St. Petersburg State University

Email: dzhemlikhanova_l@mail.ru
MD, Associate Professor of Obstetrics, Gynecology and Reproduction, Medical Faculty

Dariko Aleksandrovna Niauri

St. Petersburg State University

Email: d.niauri@mail.ru
MD, Professor, Head of the Department of Obstetrics, Gynecology and Reproduction, Medical Faculty

References

Supplementary files