Functional morphology of the placental villous tree at term singleton pregnancies, achieved by methods of assisted reproductive technology

Full Text

Введение В настоящее время в популяции увеличивается частота беременностей, индуцированных методами вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), в частности применяется экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) и перенос эмбриона (ПЭ). В мире проводится большое количество исследований, посвященных проблеме невынашивания, тем не менее данная тема остается актуальной. Это связано с расширяющимися возможностями при использовании новейших технологий и накоплением опыта в лечении бесплодия [1-3]. При этом частота бесплодных браков остается на достаточно высоком уровне без тенденции к снижению и выявляется у 15 % супружеских пар [4, 5]. По данным литературы, беременности после ЭКО сопровождаются высоким риском невынашивания (26-39 %) по сравнению с беременностями, наступившими естественным путем (0,5-2,0 %). Частота преждевременных родов составляет 30-60 % случаев, для многоплодной беременности данный показатель составляет 46,1 и 100,0 % при двойнях и тройнях соответственно, что характеризуется сопутствующими патологическими состояниями у детей (асфиксия, гипотрофия, синдром дыхательных расстройств, церебральные расстройства и др.) [6]. Мнения исследователей о состоянии здоровья детей, рожденных в результате ВРТ, крайне противоречивы. По данным D. Meschede и др., у них выявляется высокая частота развития врожденных аномалий хромосом и аутосомных транслокаций. Возможно, это является наследуемым признаком и передается потомству, что повышает у них также риск развития бесплодия [7-9]. По данным K.J. Middelburg и др., соматическое здоровье и умственно-психическое развитие детей не имеет принципиальных отличий, а связано с социальным статусом семьи и образованием родителей [10-12]. Однако ряд других исследований показали, что дети, зачатые при использовании методов ВРТ, чаще страдают различными врожденными заболеваниями и пороками развития сердечно-сосудистой и костно-мышечной систем, а также имеют проблемы в психофизическом развитии [13-18]. При оценке отдаленного неврологического и интеллектуального развития многие исследователи отмечают наличие таких психических расстройств, как аутизм, нарушение поведения, умственную отсталость или неврологические нарушения, например детский церебральный паралич [2, 19, 20]. По данным литературы, беременности, достигнутые методами ВРТ, имеют высокий риск формирования плацентарной недостаточности. Как известно, адекватное маточно-плацентарное и плодово-плацентарное кровообращение создает оптимальные взаимоотношения между матерью и плодом, при нарушении которых происходят структурно-функциональные изменения, которые могут привести к патологии внутриутробного развития плода и перинатального периода. Плацентарная недостаточность представляет собой симптомокомплекс, связанный с нарушениями трофической, эндокринной, транспортной и метаболической функций плаценты, возникающими при различных экстрагенитальных и гинекологических заболеваниях женщины [21-26]. По классификации М.В. Федоровой и Е.П. Калашниковой (1986) плацентарную недостаточность можно разделить в зависимости от срока гестации на первичную и вторичную. Первичная недостаточность условно ограничена 16-й неделей беременности и включает периоды имплантации, плацентации и раннего созревания плаценты. Ведущими факторами при этом выступают генетические, эндокринные и инфекционные. При первичной плацентарной недостаточности происходит нарушение анатомического строения плаценты, отмечаются аномалии ее расположения и прикрепления, нарушение процесса васкуляризации и созревания ворсин хориона. Исходом первичной недостаточности является гибель эмбриона и спонтанный аборт в течение I триместра беременности [27-29]. Вторичная плацентарная недостаточность возникает тогда, когда плацента уже сформировалась. Этиологическими факторами при этом выступают нарушение маточно-плацентарного кровообращения, компенсаторно-приспособительных реакций, инволюционно-дистрофические изменения и инфекционно-воспалительная патология. Вторичная недостаточность характеризуется нарушением дифференцировки ворсинчатого хориона плаценты, что морфологически проявляется в виде преждевременного созревания, патологической незрелости или диссоциированным типом развития виллезного дерева плаценты [28, 29]. Первичная и вторичная плацентарная недостаточность может иметь острое и хроническое течение. В основе острого процесса лежит нарушение маточно-плацентарного и плодно-плацентарного кровообращения. Проявлением этого служат обширные инфаркты, преждевременная отслойка плаценты с формированием ретроплацентарной гематомы, отслойка предлежащей плаценты или формирование истинного узла пуповины. Гистологическими признаками острой плацентарной недостаточности являются выраженные циркуляторные нарушения в виде полнокровия межворсинчатого пространства с формированием тромбов, инфарктов, кровоизлияний в базальную пластинку, в строму ворсин хориона в связи с полнокровием и эктазией стволовых вен, распространенным парезом капилляров терминальных ворсин. Исходом данной патологии часто является быстрое наступление гибели плода, в некоторых случаях возможно формирование хронической плацентарной недостаточности [27-29]. Хроническая форма плацентарной недостаточности может возникать рано (в начале второй половины беременности) и протекать до момента родов. В зависимости от состояния компенсаторно-приспособительных реакций выделяют абсолютную и относительную формы плацентарной недостаточности. Наиболее тяжелой формой является абсолютная плацентарная недостаточность, которая обусловлена нарушением созревания ворсинчатого хориона при циркуляторных, инволюционно-дистрофических и инфекционных повреждениях плаценты, при отсутствии на тканевом уровне условий для осуществления компенсаторно-приспособительных реакций. Данная патология приводит к гипоксии, гипотрофии и внутриутробной гибели плода [28, 29]. При относительной форме недостаточности плаценты компенсаторные реакции сохраняются на уровне, достаточном для рождения здорового и жизнеспособного плода. По степени внутриутробной задержки развития плода и сохранности адаптационно-компенсаторных реакций можно выделить компенсированную, субкомпенсированную и декомпенсированную стадии плацентарной недостаточности. При компенсированной стадии отмечаются слабовыраженные патологические изменения в фетоплацентарной системе, такие как увеличение сосудистого индекса и появление компенсаторного ангиоматоза, начальные признаки гипотрофии плода при сохранении компенсаторно-приспособительных механизмов в плаценте. При проведении своевременной терапии при беременности и родах возможно рождение здорового ребенка или рождение ребенка в состоянии асфиксии. При субкомпенсированной стадии плацентарной недостаточности отмечаются более выраженные признаки гипотрофии плода с нарушением его общего состояния и возникновением гипоксии. В плаценте определяется выраженное напряжение компенсаторных механизмов, что не обеспечивает нормального протекания беременности и родов. Гистологическая картина представлена преобладающими очагами инволюционно-дистрофических изменений стромы и хориального эпителия ворсин. Происходит отложение фибриноида в межворсинчатом пространстве разной степени протяженности от очаговых до обширных полей, определяются умеренные или выраженные сосудистые нарушения с тенденцией к снижению компенсаторных процессов. Исходом такого состояния является рождение ребенка в состоянии асфиксии средней или тяжелой степени [28, 29]. При декомпенсированной плацентарной недостаточности в фетоплацентарной системе происходят необратимые морфофункциональные изменения, приводящие к нарушению нормального протекания беременности. При этом происходит резкое снижение компенсаторно-приспособительных реакция на тканевом и клеточном уровнях. Сосудистый компонент представлен мелкими сосудами в небольшом количестве с утолщенной стенкой, при этом просвет может быть сужен и практически неразличим, в ворсинах хориона происходит гибель эпителия и фиброз стромы. Исходом данной стадии плацентарной недостаточности является мертворождение. Таким образом, исходя из вышеизложенного, целью нашего исследования является изучение морфофункционального состояния плаценты после беременности, достигнутой методами ВРТ. Материалы и методы Всего материалом для исследования послужили 98 плацент от одноплодной беременности при доношенном сроке гестации. Было сформировано две группы исследования: основная группа (n = 60) была поделена на I подгруппу, куда вошли 30 плацент от женщин с первичным бесплодием, и II подгруппу - 30 плацент от женщин с вторичным бесплодием. Группу сравнения составили плаценты от 38 женщин (12 плацент от первобеременных женщин и 26 плацент от повторнобеременных пациенток). В связи с тем что полученные результаты исследования плацент внутри данной группы не имели достоверных отличий, было принято решение объединить группу сравнения. Критерием включения в основную группу исследования явился доношенный срок беременности 37-40 недель гестации у пациенток в возрасте от 26 до 43 лет с беременностью, достигнутой методами ВРТ. Критериями исключения стал возраст младше 26 лет, плаценты от преждевременных родов или переношенной беременности, плаценты с воспалительными изменениями, плаценты от женщин с сахарным диабетом, антифосфолипидным синдромом, бронхиальной астмой или другими тяжелыми соматическими заболеваниями, плаценты при мужском факторе бесплодия. Гистологический метод исследования плацент проводился по стандартной методике с окраской гематоксилином и эозином. При световой микроскопии плаценты оценивалась структура виллезного дерева, состояние сосудистого русла ворсин хориона, хориальной и базальной пластин, межворсинчатого пространства. Иммуногистохимический метод исследования ворсинчатого хориона Для оценки экспрессии маркера клеточной адгезии CD34 в эндотелиальных клетках в ворсинчатом хорионе применялись мышиные моноклональные антитела (Dako, клон QBEnd-10, титр 1 : 25). Для оценки экспрессии eNOS в клетках ворсинчатого хориона использовались моноклональные антитела к NOS-3 (Novocastra, клон RN5, 1 : 40). Для исследования рецепторов HIF-1α использовались мышиные моноклональные антитела к HIF-1α (Abcam, клон H1alpha67, титр 1 : 50). Иммуногистохимическое исследование проводили на парафиновых срезах. Срезы ткани толщиной 5 мкм помещали на предметные стекла, покрытые пленкой из поли-L-лизина (Sigma). Для проведения иммуногистохимической реакции использовали стандартный одноэтапный протокол с демаскировкой антигена (высокотемпературной обработкой ткани) в 0,01 М цитратном буфере рН 7,6. Количественная оценка результатов исследования Препараты исследовали под микроскопом Olympus BX46 c настройкой освещения по Кёллеру при увеличении × 400. Оценку экспрессии площади исследуемых маркеров CD34, NOS-3 и HIF-1-alpha проводили с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений «Морфология 5.2» («Видео Тест», Россия). Результаты исследования В I подгруппе c первичным бесплодием у 36,7 % женщин был наружный генитальный эндометриоз, у 40,0 % - воспалительные заболевания органов малого таза (ВЗОМТ), у 16,6 % пациенток отмечалось нарушение менструального цикла и у 6,7 % - аномалии развития полового аппарата (двурогая матка). Во II подгруппе с вторичным бесплодием у 76,7 % женщин встречались ВЗОМТ. В 20,0 % случаев встречался наружный генитальный эндометриоз и 3,3 % случаев - синдром поликистозных яичников. Кроме того, исходами предыдущих беременностей во II подгруппе в 47,9 % случаев стали самопроизвольные выкидыши, в 18,3 % случаев беременность закончилась родами, на долю искусственного прерывания беременности и эктопической беременности пришлось по 16,9 %. В группе сравнения гинекологический анамнез был представлен следующим образом: эктопия шейки матки встречалась в 43,3 %, эрозия шейки матки - в 16,7 % случаев, миома матки - в 16,7 % случаев, воспалительные заболевания органов малого таза - в 20,0 % случаев и в 3,3 % была выявлена гиперплазия эндометрия. У 8 женщин гинекологической патологии выявлено не было. Исходами предыдущих беременностей у повторнобеременных женщин в группе сравнения в 44,4 % случаев были роды, в 31,5 % случаев - искусственные аборты и в 24,1 % случаев - самопроизвольное прерывание беременности. Анализ анамнестических данных пациенток показал, что средний возраст в I подгруппе составил 33,7 ± 0,8 года, во II подгруппе - 36,2 ± 0,9 года и в группе сравнения - 34,8 ± 0,45 года. При оценке массы рожденных детей в группах исследования достоверных отличий выявлено не было (в I подгруппе масса составила 3470,0 ± 77,1 г, во II подгруппе - 3381,0 ± 77,5 г, в группе сравнения - 3460,0 ± 56,3 г). Оценка состояния детей на первой минуте по шкале Апгар составила 7-8 баллов. Показатели масс плацент в исследуемых группах также не имели достоверных отличий (при первичном бесплодии масса составила 467,9 ± 18,0 г, при вторичном - 459,6 ± 17,6 г, при естественно наступившей беременности - 461,2 ± 14,25 г). При проведении гистологического исследования плацент основной группы и группы сравнения был выявлен терминальный тип строения виллезного дерева, соответствующий доношенному строку беременности в основной группе: 76,7 и 67,0 % соответственно, а в группе сравнения - 76,3 %. Хроническая плацентарная недостаточность (ХПН) при вторичном бесплодии диагностирована в 33,0 % случаях. В I подгруппе с первичным бесплодием и в группе сравнения частота встречаемости ХПН была одинакова (23,3 и 23,7 % соответственно). Среди форм плацентарной недостаточности во всех группах преобладала диссоциированная (диспластическая) форма, характеризующаяся персистенцией промежуточных ворсин зрелого и незрелого типа, гиперваскуляризацией, отеком стромы и формированием большого числа синцитиокапиллярных мембран. В I подгруппе диссоциированная форма ХПН был диагностирован в 85,7 % плацент и в 90,0 % плацент от пациенток II подгруппы. В группе сравнения данный показатель составил 88,9 %. Гипопластическая форма ХПН выявлялась в одном случае в подгруппе с вторичным бесплодием. Гиперпластическая форма ХПН встречалась при первичном бесплодии (14,3 %) и в группе сравнения (11,0 %). Среди стадий ХПН во всех группах преобладала стадия компенсации без нарушения состояния плода. Стадия субкомпенсации встречалась в одном случае в основной группе в подгруппе с вторичным бесплодием, данное состояние приводит к напряжению адаптационных процессов, гипоксии и нарушению развития плода. Наиболее часто ХПН, диссоциированная и гипопластическая формы в стадии компенсации и субкомпенсации, встречалась в группе у женщин с вторичным бесплодием, где беременность была достигнута при помощи методов ВРТ. Достоверных статистических отличий в структуре виллезного дерева плацент в группе с первичным бесплодием и группе сравнения выявлено не было. Состояние сосудистого русла плаценты является важным параметром функциональной активности плаценты. Для оценки васкуляризации ворсинчатого хориона использовался маркер CD34, экспрессирующийся в эндотелиальных клетках. Как видно из рисунка 1, экспрессия CD34 в подгруппах с бесплодием была достоверно ниже при сопоставлении с группой сравнения (р < 0,05). При оценке данного маркера в пределах основной группы экспрессия CD34 в подгруппе с вторичным бесплодием была достоверно ниже (р < 0,01). Снижение экспрессии CD34 свидетельствует о нарушении процессов васкуляризации ворсинчатого хориона. Для адекватного кровотока в плаценте большое значение имеет не только количественное, но и качественное состояние сосудистого русла. NO-синтаза является одним из главных местных плацентарных вазодилататоров, участвует в синтезе оксида азота эндотелием и регулирует сосудистый тонус, артериальное давление и кровоток. Помимо этого она участвует в защите плаценты от свободных радикалов, в регуляции процессов дифференцировки клеточного трофобласта в синцитиальный. Данные об экспрессии данного маркера представлены на рисунке 2. Из данных рисунка 2 видно, что площадь экспрессии NOS-3 в плацентах основной группы достоверно ниже при сопоставлении с группой сравнения (p < 0,001). При оценке экспрессии NOS-3 внутри основной группы наблюдалось достоверное снижение экспрессии данного маркера в подгруппе с вторичным бесплодием. Гипоксия ткани является следствием хронической плацентарной недостаточности и оказывает негативное влияние на процессы развития и созревания органов и тканей фетоплацентарной системы. Гипоксия-индуцибельный фактор (HIF-la) является одним из главных транскрипционных регуляторов генов, отвечающих за реакцию на гипоксию и активизирующихся в физиологически важных местах регуляции кислородных путей, тем самым обеспечивая ответы на гипоксический стресс, включает гены, регулирующие процесс ангиогенеза, вазомоторный контроль, энергетический метаболизм, эритропоэз и апоптоз [30, 31]. Как видно из рисунка 3, площадь экспрессии HIF-1α в плацентах основной группы исследования была достоверно выше при сопоставлении с группой сравнения (р < 0,01) и не имела достоверных отличий при сравнении внутри группы с бесплодием. Полученные данные свидетельствуют об активации HIF-1α в плацентах от детей, рожденных методом ВРТ, что, вероятнее всего, отражает более низкую устойчивость виллезного дерева к гипоксии. Обсуждение полученных результатов Проведенное анамнестическое исследование женщин с первичным и вторичным бесплодием показало, что у женщин с первичным бесплодием отмечалась равная частота встречаемости наружного генитального эндометриоза и ВЗОМТ, а среди женщин с вторичным бесплодием преобладающими были ВЗОМТ с наличием трубно-перитонеального фактора почти в половине процентов случаев. Среди массо-метрических показателей плацент, детей и их состояния на первой минуте после рождения различий не было. При гистологическом исследовании морфологической структуры плаценты было выявлено, что частота встречаемости ХПН была в 1,4 раза выше в подгруппе с вторичным бесплодием. При иммуногистохимическом исследовании плацент в основной группе выявлено достоверное снижение экспрессии маркера клеточной адгезии (CD34) в эпителии сосудов ворсин хориона и снижение экспрессии маркера сосудистого тонуса (NOS-3), что может свидетельствовать о нарушении функциональной активности сосудистого русла и повышении сосудистого сопротивления в системе плацентарного кровообращения. Полученные результаты говорят о возможном осложнении течения беременности, достигнутой методами ВРТ, с высоким риском развития гестозов и преэклампсии. Повышение экспрессии гипоксия-индуцибельного фактора (HIF-1a) в основной группе по сравнению с плацентами от детей, рожденных естественным путем, свидетельствует о гипоксическом состоянии плаценты и, следовательно, плода. Изменения в экспрессии изучаемых маркеров наиболее выражены в плацентах от детей, рожденных при вторичном бесплодии. Такие результаты вполне обоснованы, поскольку у пациенток с вторичным бесплодием в анамнезе присутствовала высокая частота встречаемости воспалительных заболеваний органов малого таза, а также высокий процент инструментальных вхождений в полость матки (искусственные аборты, самопроизвольные выкидыши, эктопические беременности), что может привести к нарушению морфофункционального состояния эндометрия [32]. Патология эндометрия при первичном и вторичном бесплодии может стать причиной нарушения формирования функциональной и морфологической структуры плацентарного комплекса и возникновения в дальнейшем плацентарной недостаточности. Отсутствие достоверных отличий в состоянии детей на момент рождения не исключает возможности возникновения патологических процессов в перинатальном периоде, что может осложнить постнатальное развитие ребенка.

About the authors

Aleksandra K Sosnina

Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott

Email: aleksandrasosnina@bk.ru
Postdoctoral student of Department patomorphology

Tatyana G Tral

Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott

Email: TTG2008@bk.ru
PhD, MD, Pathologist. Head of Pathologist Laboratory, Department of Pathomorphology

Julia S Krylova

Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott

Email: emerald2008@mail.ru
PhD, MD, Scientist. Laboratory of Cell Biology, Department of Pathomorphology

References

Supplementary files