Immunohistochemical criteria of the functional placental maturity estimation

Full Text

Введение

Здоровье новорожденного ребенка в значительной степени определяется течением антенатального периода. Нарушение функций плаценты — одна из основных причин перинатальной заболеваемости и смертности [3]. Еще в середине XX века известный классик отечественной плацентологии А.И.Брусиловский писал: «...мы постепенно приближаемся к прочтению плаценты как визитной карточки плода...» [2].

Важнейшей функцией плаценты является синтез и секреция широкого спектра биологически активных веществ. Многочисленные плацентарные пептиды (их верифицировано уже более 100) выполняют роль гормонов, ферментов, проферментов, ингибиторов, рецепторов, факторов роста, иммунорегуляторных агентов, транспортных и связывающих белков. Уникальность этого органа в плане механизмов интеграции выполняемых функций и присутствия в нем основных регуляторных нейропептидов позволяют считать плаценту одним из важных отделов диффузной нейроэндокринной системы, впервые описанной А.С. Pearse в конце 60—х годов XX века [7].

Объектом нашего исследования был выбран ворсинчатый хорион, так как в силу особенностей строения он играет наиболее важную роль в осуществлении обменных процессов между кровью матери и плода. Доказано, что наиболее активной тканью плаценты в метаболическом и функциональном плане является эпителий ворсинчатого хориона.

Широкие возможности в изучении гормонального статуса плаценты связаны с появлением методов, позволяющих не только изучить особенности гистологического строения и состояния обменных процессов, но и количественно оценить функциональное состояние различных структурных компонентов плаценты.

Расширению знаний способствует бурное развитие молекулярной микроскопии с помощью иммуноморфологических реакций на срезах на тканевом, клеточном и ультраструктурном уровнях исследования, позволяющих визуализировать макромолекулы гормонов, отдельных ферментов, рецепторов, коллагенов различных типов и т.п. Среди иммуногистохимических методов, широко применяемых как в клинической практике, так и в научно—исследовательской работе, одним из наиболее перспективных и высокочувствительных является авидин (или стрептавидин)—биотиновый (АВС) иммунопероксидазный метод.

Анализ современной литературы показал, что большинство исследователей изучали развитие адаптационных механизмов при патологическом состоянии плаценты. Вместе с тем, необходимо отметить недостаточное внимание к вопросам развития компенсаторно—приспособительных реакций, степени их мобилизации в плацентах у женщин с нормальной физиологической беременностью в зависимости от их возраста. Имеются сведения, касающиеся степени структурных и функциональных сдвигов в плацентах у женщин различного возраста с нормальной физиологической беременностью [4, 5], тогда как исследование нормальной плаценты ограничивалось лишь констатацией процессов, свидетельствующих о функциональном старении органа. Между тем, от степени выраженности этих изменений зависит выключение больших или меньших участков из обменной поверхности плацентарной ткани.

Плацента уникальна и как объект для геронтологических исследований, поскольку ее онтогенез четко очерчен по времени гестации, а плацентарная ткань удобна для поиска четких, согласованных критериев старения на органном, тканевом, клеточном и субклеточном уровнях. В настоящее время убедительные морфологические доказательства истинного старения плаценты отсутствуют, и вопрос «старения» плаценты остается дискуссионным. В литературе нами не найдено работ, касающихся изучения гормональной функции плаценты в связи со старением этого органа.

В основу клинической концепции «старения» плаценты положены исследования переношенной беременности. В связи с этим исследование экспрессии гормонов при доношенной и переношенной беременности также представляется актуальной темой для исследования.

Материалы и методы

Объектом для морфо—функционального исследования был избран ворсинчатый хорион 57 доношенных и 14 переношенных плацент, полученных при родах в родильном отделении НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН. При анализе морфо—функционального состояния исследуемых плацент использованы заключения патогистологических исследований последов, проведенных в лаборатории патоморфологии института.

Изучение функциональной активности ворсинчатого хориона в зависимости от возраста беременной проводили на иммуногистохимических препаратах, приготовленных из образцов доношенных плацент женщин различного возраста. Были отобраны плаценты первородящих женщин со срочными родами без осложнений. В ходе проведения исследования материал был распределен на 5 групп в зависимости от возраста женщин (табл.). В качестве группы сравнения нами была выбрана группа 2 — плаценты женщин нормального репродуктивного возраста (от 18 до 28 лет).

Для оценки функциональной активности плацент были использованы антитела к следующим иммуногистохимическим маркерам:

• мелатонину и пролактину — для оценки гормонального статуса плаценты;
• СD34—маркеру эндотелия — для оценки степени васкуляризации ворсин;
• эндотелиальной NO—синтазе как антиоксиданту и регулятору сосудистого тонуса, кровотока и артериального давления;
• HLA—DR и CD35 — для оценки иммунологического статуса плаценты;
• Мс1—1 (антиапоптозному) и р53 (апоптоз— ному) маркерам — для оценки пролиферативной активности плаценты.

Кусочки плаценты объемом 1 см³ фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине (pH 7,2), обезвоживали и заливали в парафин согласно общепринятой схеме. Для обзорной окраски использовали гематоксилин и эозин.

Иммуногистохимическое исследование проводили с использованием моноклональных мышиных антител к пролактину человека (1:200, Novocastra), эндотелиальной NO—синтазе (1:150, Novocastra), маркеру дендритных клеток CD35 (1:100, Novocastra), антигену главного комплекса гистосовместимости II класса HLA—DR (1:100, Novocastra), маркеру эндотелиальных клеток CD34 (1:100, Novocastra) человека, антиапоптозному белку Мс1—1 (1:100, Novocastra), проапоптозному белку р53 (1:75, Novocastra). Для визуализации экспрессии мелатонина использовали ультраспецифичные кроличьи антитела к мелатонину (1:100, CIDtech Res. Comp.) В качестве вторых антител использовали универсальный набор, содержащий биотинилированные антимышиные и антикроличьи иммуноглобулины. Визуализацию окрасок проводили с применением комплекса авидина с биотинилированной пероксидазой (ABC—kit), с последующим проявлением пероксидазы хрена диаминобензидином (все реагенты от Novocastra).

 

Таблица. Распределение плацент по группам в зависимости от возраста женщин

№ группы	Возраст женщин, лет	Число обследованных женщин	Процент от числа обследованных женщин в каждой группе
I группа	до 18	8	14
II группа	18—28	22	38,5
III группа	29—35	13	22,5
IV группа	36—40	9	16
V группа	Старше 40	5	9

 

Морфометрическое исследование проводили с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений, состоящей из микроскопа Nikon Eclipse Е400, цифровой камеры Nikon DXM1200, ПК на базе Intel Pentium 4 и программного обеспечения «Видеотест—Морфология 4.0». В каждом случае измерение проводили в 10 полях зрения при 400—кратном увеличении. Оптическую плотность экспрессии выявленных продуктов измеряли в условных единицах. Также определяли площадь их экспрессии (которая представляла собой отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения), выражаемую в процентах. Указанные параметры отражают интенсивность синтеза или накопления исследуемых гормонов и сигнальных молекул.

Результаты исследований обрабатывали с помощью компьютерных программ Excel и Statistica 5.0 (StatSoft).

Результаты исследования

Иммуногистохимическое исследование доношенных плацент

На всех иммуногистохимических препаратах была отмечена выраженная экспрессия исследуемых маркеров: мелатонина, пролактина, CD34, NO—синтазы, HLA—DR, CD35, Мс1—1, р53.

Экспрессия мелатонина была выявлена во всех структурных элементах ворсинчатого хориона: синцитиотрофобласте, синцитиокапиллярных мембранах, синцитиальных почках и узлах, единичных клетках стромы и эндотелии сосудов.

Площадь экспрессии мелатонина в 1, 3, 4 и 5—й группах была достоверно меньше, чем в группе 2 — группе сравнения (р<0,05) (рис. 1). Между возрастом матери и значениями площади экспрессии мелатонина выявлена положительная корреляция (к=0,06).

 

Рис. 1. Площадь экспрессии мелатонина в плацентах беременных различных возрастных групп

 

Оптическая плотность мелатонина достигает максимального значения во 2—й группе (0,34±0,01 у.е.), у женщин старше 36 лет (4 и 5—я группы) наблюдается достоверное снижение этого показателя (р<0,05) (рис. 2).

 

Рис. 2. Оптическая плотность экспрессии мелатонина в плацентах беременных различных возрастных групп

 

Пролактин—иммунопозитивные клетки обнаружены в синцитиотрофобласте, в том числе и в синцитиокапиллярных мембранах, а также в эндотелии сосудов. Оптическая плотность в 1, 2, 3 и 4—й группах достоверно не отличается; достоверно меньшая величина оптической плотности наблюдалась в плацентах у женщин старше 40 лет (р<0,05) (рис. 3). Площадь экспрессии пролактина в плаценте у женщин старше 29 лет достоверно уменьшается (р<0,05) (рис. 4), что свидетельствует о сокращении числа иммунопозитивных клеток к пролактину.

 

Рис. 3. Оптическая плотность экспрессии пролактина в плацентах беременных различных возрастных групп

 

Рис. 4. Площадь экспрессии пролактина в плацентах беременных различных возрастных групп

 

Полученные данные свидетельствуют о снижении гормональной активности в плодовой части плаценты с увеличением возраста беременной.

Положительная иммуногистохимическая реакция с антителами к CD34 наблюдалась на всех препаратах в эндотелии капилляров ворсин хориона. Степень экспрессии CD34 у женщин нормального репродуктивного возраста (2—я группа) значительно превышает уровень экспрессии этого маркера в остальных возрастных группах как по площади экспрессии, так и по показателям оптической плотности (рис. 5, 6). 

 

Рис. 5. Оптическая плотность экспрессии CD34 в плацентах беременных различных возрастных групп

 

Рис. 6. Площадь экспрессии CD34 в плацентах беременных различных возрастных групп

 

Между показателями оптической плотности и возрастом женщин выявлена корреляционная связь (k= 0,23).

Полученные результаты свидетельствуют о прямом влиянии возраста матери на степень васкуляризации ворсинчатого хориона.

Среди местных плацентарных вазодилататоров наибольшая роль отводится эндотелиальной NO—синтазе. Проведенные иммуно—гистохимические исследования показали, что синцитиотрофобласт, синцитиокапиллярные мембраны, эндотелий капилляров ворсин давали иммунопозитивную реакцию с антителами к эндотелиальной NO—синтазе. Оптическая плотность и площадь экспрессии eNOS достоверно меньше у женщин моложе 18 и старше 28 лет (р<0,05) (рис. 7, 8).

 

Рис. 7. Оптическая плотность экспрессии NO—синтазы в плацентах беременных различных возрастных групп

 

Рис. 8. Площадь экспрессии NO—синтазы в плацентах беременных различных возрастных групп

 

Для оценки состояния иммунной системы плаценты в связи с различным возрастом беременных использовали маркер фолликулярных дендритных клеток CD35 и антиген II класса главного комплекса гистосовместимости HLA—DR.

Единичные СП35—содержащие клетки локализуются преимущественно в строме стволовых и промежуточных ворсин, а также в просветах стромальных каналов. При оценке площади экспрессии данного маркера выявлены достоверные отличия между 4 и 2, а также 5 и 2 группами (р<0,05) (рис. 10), в то время как в значениях оптической плотности не найдено статистически достоверных отличий между группами (рис. 9). Проведенный анализ показал наличие корреляции между возрастом беременных и значениями площади экспрессии CD35 (k= 0,37), что указывает на увеличение активности СП35—презентирующих клеток в связи с возрастом беременной женщины.

 

Рис. 9. Оптическая плотность экспрессии CD35 в плацентах беременных различных возрастных групп

 

Рис. 10. Площадь экспрессии CD35 в плацентах беременных различных возрастных групп

 

Экспрессия антигена главного комплекса гистосовместимости II класса HLA—DR наблюдалась в строме, капиллярах ворсин, а также в синцитии. Обнаружена положительная корреляция между значениями площади экспрессии HLA—DR и возрастом беременных (к=0,39) (рис. 12). Достоверных отличий в значениях оптической плотности не было обнаружено (рис. 11).

 

Рис.11. Оптическая плотность экспрессии HLA—DR в плацентах беременных различных возрастных групп

 

Рис. 12. Площадь экспрессии HLA—DR в плацентах беременных различных возрастных групп

 

Таким образом, нами выявлены неоднозначные отличия в экспрессии иммунокомпетентных антиген—презентирующих молекул в плацентах у женщин разного возраста. Обнаружена тенденция к увеличению экспрессии CD35 и уменьшению экспрессии HLA—DR с увеличением возраста беременной.

 

Иммунопозитивное окрашивание к Мс1—1 наблюдалось практически во всех структурах ворсинчатого хориона: синцитиальном трофобласте, синцитиокапиллярных мембранах, клетках стромы, эндотелии сосудов, что свидетельствует о высокой пролиферативной активности этих элементов даже на поздних сроках беременности.

Межгрупповых различий в значениях оптической плотности Мс1—1 нами не выявлено (рис. 13), однако была показана положительная корреляция между значениями оптической плотности и возрастом беременных (к=0,27).

 

Рис. 13. Оптическая плотность экспрессии Мс1—1 в плацентах беременных различных возрастных групп

 

Площадь экспрессии Мс1—1 максимальна в плацентах женщин нормального репродуктивного возраста (7,81±0,07 %). У женщин 1 группы площадь экспрессии составляет 6,9±0,03 %, между этими величинами обнаружены достоверные отличия (р<0,05). Площадь иммунопозитивно окрашенных клеток в 3, 4 и 5—й группах достоверно ниже, чем в группе 2 (рис. 14).

 

Рис. 14. Площадь экспрессии Мс1—1 в плацентах беременных различных возрастных групп

 

Единичные клетки, вступившие в апоптоз и экспрессирующие протеин р53, встречаются в синцитиотрофобласте и в строме ворсин хориона.

Значения оптической плотности и площади экспрессии этого белка прогрессивно увеличиваются с возрастом беременной (рис. 15, 16). Возраст беременной положительно коррелирует с площадью экспрессии белка р53 (к=0,43) и оптической плотностью (к=0,25).

 

Рис. 15. Площадь экспрессии р53 в плацентах женщин различных возрастных групп

 

Рис. 16. Оптическая плотность экспрессии р53 в плацентах беременных различных возрастных групп

 

Полученные результаты позволяют сделать вывод о снижении пролиферативной активности плаценты и увеличении числа клеток, вступивших в апоптоз в связи с увеличением возраста беременной.

Иммуногистохимическое исследование «старения» плаценты

В основу клинической концепции «старения» плаценты положены исследования переношенной беременности [6]. В связи с этим для изучения феномена «старения» плаценты были исследованы 14 плацент, полученных при переношенной беременности у женщин 18—28 лет и проведен сравнительный анализ экспрессии исследуемых маркеров в зрелой и переношенной плаценте.

Экспрессия пролактина, мелатонина, CD34, NO—синтазы, CD35, Мс1—1 и р53 были выявлена на всех препаратах при переношенной беременности.

Все исследуемые маркеры были визуализированы в плаценте при переношенной беременности в тех же структурах ворсинчатого хориона, что и при срочной беременности. Статистический анализ данных не выявил значимых отличий в показателях оптической плотности и площади экспрессии всех иммуногистохимических маркеров в плацентах при доношенной и переношенной беременности.

Обсуждение результатов

Исследование гормональной активности ворсинчатого хориона на поздних сроках беременности показало, что все структурные элементы ворсинчатого хориона принимают активное участие в синтезе, депонировании и секреции гормонов и биологически активных веществ.

Анализ макро— и микроскопического строения плацент выявил структурно—функциональные изменения этого органа в связи с возрастом беременной — чем старше женщина, тем выше степень повреждения плаценты. Если в возрасте 18—23 лет межворсинчатое пространство почти свободно от крови, тромбов и фибрина, то уже в возрасте 24—29 лет появляются нарушения фетального и материнского кровообращения. В межворсинчатом пространстве выявляются обширные кровоизлияния, выпадение фибрина и образование фибриноида. В строме конечных ворсин отмечаются дистрофические процессы в виде отека, который чаще встречается и в большей степени выражен (иногда — с образованием конечных полостей и отслойкой симпласта) у женщин до 30 лет. В строме ряда ворсин обнаруживаются некротические изменения [1].

Таким образом, возрастные процессы в плаценте проявляются комплексом изменений, захватывающих все структурные единицы плаценты: соединительную ткань и трофобласт, клеточные мембраны и систему кровообращения. Важнейшую роль в развитии возрастных изменений играет недостаточная васкуляризация [2].

Результаты данного исследования свидетельствуют о сохранении функциональной зрелости плаценты при переношенной беременности. По—видимому, «старение» плаценты обусловлено в большей степени общим состоянием организма беременной, нежели сроком гестации, иными словами, «старение» плаценты, как и любого органа в организме беременной женщины, происходит соответственно ее биологическому возрасту.

About the authors

Е. К. Aylamazyan

Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com

Academician of the Russian Academy of Medical Sciences, Honored Scientist of the Russian Federation, Professor

Russian Federation, Saint Petersburg

Е. А. Lapina

Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Saint Petersburg

I. М. Kvetnoy

Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files