Dydrogesterone (duphaston) and its 20-dihydro- metabolite as selective modulators of estrogenic enzymes in human breast cancer cells

Full Text

Влияние на активность сульфатазы и 170—гидростероид—дегидрогеназ^1,2

Доказано, что ткань рака молочной железы содержит все ферменты, ответственные за локальный биосинтез эстрадиола (Е₂) из циркулирующих предшественников. Последние этапы образования эстрадиола в опухолевых тканях молочной железы проходят двумя основными путями: «ароматазным», трансформирующим андрогены в эстрогены [1, 2], и «сульфатазным», который превращает сульфат эстрона (E₁S) в эстрон (Е₁ )при помощи эстронсульфатазы [3—5]. Последний этап стероидогенеза — это преобразование более слабого эстрона в мощный биологически активный эстрадиол за счет редуктазной активности 17 β —гидростероид—дегидрогеназы 1 типа (17β—ГСД—1) [6—8].

Количественная оценка показывает, что в опухолевых тканях молочной железы предшественником эстрадиола скорее всего является сульфат эстрона, а не андростендион, таким образом, синтез эстрадиола происходит преимущественно «сульфатазным» путем. [9— 11].

Также было установлено, что в тканях рака молочной железы присутствуют стероидные сульфотрансферазы, превращающие эстрогены в их сульфаты [12—14]. Вся эта информация расширяет понятие «интракринологии», согласно которому гормон действует в том же самом органе, в котором он образуется.

В данном исследовании мы изучали влияние дидрогестерона (дюфастона ) и его 20—дигидро—метаболита на эстрон—ульфатазу в линиях MCF—7 и T—47D клеток рака молочной железы, а также на редуктазную активность 17β—гидростероид—дегидрогеназы 1 типа в клетках T—47D.

Материалы и методы

Химические препараты

[6,7—³Н(N)]—эстрона сульфат (³H—E₁S); соль аммония (сп. акт. 53 Ci/mmol); [6,7—³Н(N)]—эстрон (³H—E₁) (сп. акт. 49 (Ci/mmol); [4—¹⁴С]—эстрадиол (¹⁴С—Е₂) (сп. акт. 57 mCi/mmol) были приобретены в New England Nuclear Division (PerkinElmer Life Sciences, Courtaboeuf, France). Чистота радиоизотопов определялась перед применением при помощи тонкослойной хроматографии (ТСХ) в соответствующей системе. Эстрона сульфат, соль аммония, немеченые эстрон и эстрадиол (аналитического уровня) были получены от Sigma—Aldrich Chimie (St. Quentin Fallavier, France). Дидрогестерон (дюфастон: (9β,10α)—прегна—4,6—диен—3,20—дион) и его метаболит — 20—дигидро—дидрогестерон — были предоставлены Solvay Pharmaceuticals GmbH (Hannover, Germany). Все другие химические препараты высшего качества приобретались коммерческим путем.

Клеточная культура

Гормонозависимые MCF—7 и T—47D линии клеток рака молочной железы человека были любезно предоставлены д—ром R.C. Clarke (Georgetown University, Washington, USA). Клетки выращивались в минимальной эссенциальной среде Игля (МЭС), в буфере с 10 ммоль/л HEPES (органический химический буфер, pH 7,6), с добавлением 2 ммоль\л L—глютамина, 100 Е\мл пенициллин—стрептомицина и 5 % сыворотки плода теленка (СПТ) (A.T.G.C., Маrnеla—Vallee, France) для T—47D, или 10 % СПТ для клеток MCF—7 и инкубировались при 37 °C в увлажненной атмосфере 5 % СО₂. Среды менялись два раза в неделю. Клетки высевались каждые 10—12 дней и переносились в чаши площадью 75 см² (A.T.G.C.) — 3 х 10⁶ клеток на чашу. За четыре дня до эксперимента клетки переносились в МЭС, содержащую 5 % СПТ, лишенную стероидов специальной обработкой. Для удаления эндогенных стероидов эта СПТ обрабатывалась древесным углем, покрытым декстраном (УПД) (0,1—1 % вес\об, УПД—СПТ), в течение ночи при 4 °C.

Выделение и количественное определение [³Н]— эстрадиола из клеток рака молочной железы человека, инкубированных с [³Н]—эстрон сульфатом

Преконфлюэнтные^[3] клетки культивировали в среде МЭС—УПД—СПТ с добавлением 5x10^—9 моль/л [³Н]—эстрона сульфата отдельно (контрольные клетки) или в сочетании с различными составами: дидрогестерон или его метаболит 20—дигидро—дидрогестерон, растворенный в этаноле (конечная концентрация <0,3 %), при диапазоне концентраций 5х10^—5— 5x10^—7—5x10^—9 моль/л.

Контрольные клетки растворялись только в этаноле. Через 24 часа среда удалялась, клетки дважды промывались ледяным буферным солевым раствором Хэнка (БСРХ, свободным от кальция и магния) (A.T.G.C) и собирались путем соскабливания.

После центрифугирования Соскоб обрабатывался 80 % этанолом и подвергался радиоактивной обработке минимум 24 часа при температуре —20 °C. Поглощение радиоактивности клетками определялось в супернатанте этанола, содержание ДНК в остальном соскобе оценивалось по Бартону [15]. Для контроля аналитических потерь добавлялся [¹⁴С]—эстрадиол (5,000 dpm), а немеченые эстрон и эстрадиол (50 мкг) применялись в качестве носителей и эталонных индикаторов. В совокупных этаноловых экстрактах эстрадиол изолировался при помощи тонкослойной хроматографии на силикагеле 60F254 (Merck, Darmstadt, Germany), оснащенным хлороформ— этилацетатной системой (4:1, об\об). После визуализации эстрогенов в ультрафиолетовом свете при 254 нм, соответствующие участки разрезались на мелкие фрагменты, помещались в пробирки для сцинтилляции жидкостей с этанолом (0,5 мл) и подвергались экстракции в течение 30 минут. Содержание ³Н и ¹⁴С анализировалось после добавления 3 мл опти—фтора (Packard, PerkinElmer Life Sciences), с холодовой коррекцией для стандартизации. Количественно содержание эстрадиола определялось как процент от общей радиоактивности, связанной с клетками и затем выражалось в фмоль образовавшегося Е₂/мг ДНК.

Выделение и количественное определение [³Н]—эстрадиола из T—47D клеток рака молочной железы человека, инкубированных с [³Н]—эстроном

Преконфлюэнтные клетки T—47D инкубировались в течение 24 часов при 37 °C в МЭС, содержащей 5x10^—9 моль\л [³Н]—эстрона в отсутствии или присутствии дидрогестерона (дюфастона) или его метаболита 20—дигидро—дидро— гестерона (5x10^—5—5x10^—7—5x10^—9 моль\л). В конце инкубации среду удаляли, клетки промывали, собирали, центрифугировали и анализировали, как ранее описано в экспериментальном разделе о конверсии [³Н]—сульфата эстрона в [³Н ] —эстрадиол.

Качественный анализ и количественная оценка эстрона и эстрадиола проводились после изоляции при помощи ТСХ на пластинах силикагеля 60F254, снабженных системой хлороформ— этилацетат (4:1, об\об). Для контроля аналитических потерь добавлялся [ ¹⁴С]—эстрадиол (5,000 dpm), а в качестве носителей и эталонных индикаторов применялись немеченые эстрон и эстрадиол (50 мкг). После визуализации эстрогенов в ультрафиолетовом свете при 254 нм соответствующие участки разрезали на мелкие фрагменты, помещали в пробирки для сцинтилляции жидкостей с этанолом (0,5 мл) и оставляли для экстракции на 30 минут. Добавляли 3 мл опти—фтора (Packard, Rungis, France) и пробирки анализировались на содержание ³Н и ¹⁴С с применением холодовой коррекции для стандартизации. Количественная оценка трансформации [³Н]—эстрона в [³Н]—эстрадиол, соответствующая редуктазной активности 17β—ГСД через 24 часа, производилась путем подсчета процента общей радиоактивности, связанной с клетками или средой и затем выражалась в фмоль Е₂\мг ДНК.

Статистический анализ

Данные представлены как показатели средних значений±стандартная ошибка средних значений (СОС). Для оценки достоверности применялся t—тест Стьюдента; показатели считались достоверными при р<0,05.

Результаты

Влияние дидрогестерона (ДИД) и его метаболита 20—дигидро—дигидрогестерона (ДГД) на активность эстрон—сульфатазы в гормонозависимых клеточных линиях MCF—7 и T—47D рака молочной железы человека

 

Поскольку сульфат эстрона является наиболее важным предшественником эстрадиола в тканях рака молочной железы, особенно актуальным представляется поиск соединений, способных действовать как селективные модуляторы эстрогенных энзимов путем подавления активности эстрон—сульфатазы и 17β—гидростероид—дегидрогеназы или стимуляции активности сульфотрансферазы в клетках рака молочной железы. С этой целью мы протестировали способность дидрогестерона (дюфастона) и его 20—дигидро—метаболита (рис. 1) блокировать сульфатазный путь в клетках рака молочной железы.

 

Рис. 1. Структура прогестагенов: дидрогестерона и его метаболита 20—дигидро —дидрогестерона

 

Когда физиологические концентрации [³Н]—эстрона сульфата — 5x10^—9 М — инкубировались с гормонозависимыми клеточными линиями MCF—7 и T—47D рака молочной железы в течение 24 часов при 37 °C, внутриклеточная продукция эстрадиола в обеих линиях клеток была повышена (1975±211 и 1216±142 фмоль/мг ДНК для MCF—7 и T—47D клеток, соответственно) (табл. 1 и 2).

 

Таблица 1. Влияние дидрогестерона и его метаболита 20—дигидро—дидрогестерона на превращение [3Н]—эстрона сульфата в [3Н]— эстрадиол в гормонозависимой MCF—7 линии клеток рака молочной железы

Эстрона сульфат, меченный тритием, [3H]—E1S (5x10—9 моль\л)	Эстрадиол (Е2), фмоль Е2\мг ДНК 1975±211
	+Дидрогестерон (ДИД)	+20—Дигидро—дидрогестерон (ДГД)
5X10—9	1791±135	1520±96*
5X10—7	1701±104	688±103*
5x10—5	727±90*	510±86*

Преконфлуентные MCF—7 инкубировали в течение 24 часов при 37°С только с эстрон сульфатом ([3H]—E1S: 5x10—9 моль\л) или в присутствии дидрогестерона или его метаболита 20—дигидро—дидрогестерона в диапазоне концентраций 5x10—9 до 5х1(У5 моль\л. Эстрадиол в фмоль\мг ДНК анализировали и количественно определяли как показано в разделе «Материалы и методы». Значения выражались как среднее±S.D. 2—х независимых дублирующих определений.

* — р<0,05 по сравнению с контрольными показателями (только [3H]—E1S).

 

Таблица 2. Влияние дидрогестерона и его метаболита 20—дигидро—дидрогестерона на переход [3Н]—эстрон—сульфата в [3Н]—эстрадиол в гормонозависимой линии T—47D клеток рака молочной железы

Эстрона сульфат, меченный тритием, [3H]—E1S (5x10—9 моль\л)	Эстрадиол (Е2), фмоль Е2\мг ДНК 1216±142
	+Дидрогестерон (ДИД)	+20—Дигидро—дидрогестерон (ДГД)
5x10—9	1279±170	1114±137
5x10—7	1040±139	846±100*
5х1О—5	643±84*	591±58*

Преконфлуэнтные клетки T—47D инкубировали в течение 24 часов при 37 °C только с эстрон—сульфатом ([3H]E1S: 5×10—9 моль\1) или в присутствии дидрогестерона или его метаболита 20—дигидро—дидрогестерона в диапазоне концентраций от 5×10—9 до 5×10—5 моль\л. Эстрадиол (в фмоль\мг ДНК) анализировали и количественно определяли как показано в разделе «Материалы и методы». Значения выражались как среднее±S.D от двух независимых дублирующих определений.

* — р<0,05 по сравнению с контрольными показателями (только [3H]—E1S).

 

Таблица 3. Влияние дидрогестерона и его метаболита 20—дигидро—дидрогестерона на превращение [3Н]—эстрона в [3Н]—эстрадиол в гормонозависимой линии T—47D клеток рака молочной железы

Эстрона сульфат, меченный тритием, [3H]—E1S (5x10—9 моль\л)	Эстрон (E1), фмоль/мг ДНК 2034±151		Эстрадиол (Е2), фмоль/мг ДНК 2110±134
	+Дидрогестерон (ДИД)		±20—Дигидро—дидрогестерон (ДГД)
	Эстрон (Е1)	Эстрадиол (Е2)	Эстрон (Е1)	Эстрадиол (Е2)
5x10—9	2400±128	1640±105*	2110±96	1428±76*
5x10—7	2860±107	1400±98*	2714±125	1242±104*
5x10—5	2750±146*	1102±112*	2405±82	975±85*

Преконфлуэнтные клетки T—47D инкубировали в течение 24 часов при 37 °C только с эстроном ([3H]—E1: 5 x10—9моль\л) или в присутствии дидрогестерона или его метаболита 20—дигидро—дидрогестерона с диапазоном концентраций от 5х10—9 до 5 х10—5 молъ\л. Эстрон и эстрадиол (в фмоль\мг ДНК) анализировали и количественно определяли как показано в разделе «Материалы и методы». Значения выражались как среднее±S.D. от 2—х независимых дублирующих определений.

* — р<0,05 по сравнению с контрольными данными (только [3H]—E1).

 

Дидрогестерон существенно препятствовал активности эстрон—сульфатазы только при концентрации 5х10^—5 М (—63 и —48 % подавления в клетках MCF—7 и T—47D, соответственно. 20—дигидро—метаболит значительно снижал продукцию эстрадиола из сульфата эстрона в зависимости от дозы в обеих линиях клеток. Ингибирующий эффект был высоким при концентрации 5х10—5 М ( — 74 и —51 % в MCF—7 и T—47D клетках, соответственно). При более низких концентрациях ингибирующий эффект на клетки MCF—7 составил —65 и —24 % при 5 х 10—7 и 5 х 10—9М, соответственно. Для клеточных линий T—47D показатели составили —31 и —9%, соответственно (рис. 2 и 3). Значения IС50, соответствующие 50 % ингибированию конверсии эстрона сульфата в эстрадиол, были 9,8 х 10—6 М для дидрогестерона и 7,1 х 10—8 М для 20—дигидро—метаболита в линии клеток MCF—7.

 

 Рис. 2. Влияние дидрогестерона и его метаболита 20— дигидро—дидрогестерона на конверсию эстронсульфата (Е1S) в эстрадиол (Е2) в гормонозависимых линиях MCF—7 клеток рака молочной железы человека:

 

Преконфлюэнтные клетки T—47D инкубировались в течение 24 часов при 37 °C только с эстрон сульфатом в физиологической концентрации ([³H]—E₁S:5х10^—9 моль\л) (контроль — необработанные клетки) или в присутствии дидрогестерона или его 20—дигидро—метаболита в диапазоне концентраций от 5x10^—9 до 5x10^—5 моль\л. Концентрация эстрадиола определялась после разделения гормонов, как показано в «Материалах и методах». Процент влияния (в фмоль Е₂/мг ДНК, образовавшегося из Е₁S) был рассчитан посредством отношения: [(тест—контроль)/контроль]х100. Представлены средние значения данных±СОС в 2—х независимых дублирующих определениях. * — р ≤ 0,05 по сравнению с контрольными данными

 

Рис. 3. Влияние дидрогестерона и его метаболита 20—дигидро—дидрогестерона на конверсию эстронсульфата (E1S) в эстрадиол (Е2) в гормонозависимых линиях T—47D клеток рака молочной железы человека:

Преконфлюэнтные клетки MCF—7 инкубировались в течение 24 часов при 37 °C только с эстрон—сульфатом в физиологической концентрации ([³H]—E₁S:5х10^—9 моль\л) (в качестве контроля — необработанные клетки) или в присутствии дидрогестерона или его 20—дигидро—метаболита в концентрациях от 5x10^—9 до 5х10^—5 моль\л. Концентрация эстрадиола определялась после разделения гормонов, как указано в разделе «Материалы и методы». Процент влияния (в фмоль Е₂/мг ДНК, образовавшегося из E₁S) был рассчитан посредством отношения: [(тест— контроль)/контроль]х100. Представлены средние значения данных±СОС в 2—х независимых дублирующих определениях. * — р ≤ 0, 05 по сравнению с контрольными показателями

 

Влияние дидрогестерона (ДИД) и его метаболита 20—дигидро—дидрогестерона (ДГД) на активность 17β—гидроксистероид—дегидрогеназы в гормонозависимой клеточной линии T—47D рака молочной железы человека

 

Основным этапом «сульфатазного пути» при образовании биологически активного эстрогена — эстрадиола — является переход эстрона в эстрадиол за счет редуктазной активности 17β—гидроксистероид—дегидрогеназы. Поэтому исследование влияния дидрогестерона и его 20—дигидро—метаболита на образование эстрадиола по этому метаболическому пути было особенно заманчивым.

В недавно проведенных исследованиях было показано, что в гормонозависимых клетках рака молочной железы преобладает это «редуктазное» направление (переход эстроана в эстрадиол). Когда в клетках T—47D в качестве предшественника инкубировался только насыщенный тритием эстрон ([³Н]—Е₁) в физиологической концентрации (5 х 10^—9 М) без добавления каких—либо кофакторов в течение 24 часов при 37 °C, то продукция [³Н]—эстрадиола составляла 2110±134 фмоль\мг ДНК, а скорость превращения приблизительно 51 %, (табл. 3). Дидрогестерон очень эффективно снижал конверсию эстрона в эстрадиол в зависимости от дозы, ингибирующий эффект на конверсию эстрона в эстрадиол по сравнению с контрольными величинами, при концентрациях 5х10^—5, 5х10^—7 и 5х10^—9М составил —48, —34 и —23 %, соответственно. Значения для 20—дигидрометаболита составили —54, —42 и —33 %, соответственно (рис. 4). Показатель IС₅₀, соответствующий 50 % ингибирования конверсии Е₁ в Е₂, для 20—дигидро—метаболита был равен 9х 10^—6 М.

 

Рис. 4. Влияние дидрогестерона и его метаболита 20—дигидро—дидрогестерона на конверсию эстрона (Е1) в эстрадиол (Е2) в гормонозависимых линиях T—47D клеток рака молочной железы человека:

 

Преконфлюэнтные клетки T—47D инкубировались в течение 24 часов при 37 °C только с эстроном в физиологической концентрации ([³H]—E₁S 5x10^—9 моль\л (контроль — необработанные клетки) или в присутствии дидрогестерона или его 20—дигидро— метаболита в концентрации от 5 х 10^—9 до 5 х 10^—5 моль\л. Количество эстрона и эстрадиола определялось после разделения гормонов, как описано в «Материалах и методах». Процент влияния (в фмоль образовавшегося Е₁ или Е₂ на мг ДНК) был рассчитан посредством отношения: [(тест —контроль)/контроль] х 100. Представлены средние значения данных±СОС в 2—х независимых дублирующих определениях. * — р ≤ 0,05 по сравнению с контрольными величинами

Обсуждение

В течение многих лет гормонотерапия при раке молочной железы главным образом основывалась на использовании антиэстрогенов, блокирующих эстрогенные рецепторы. Лечение антиэстрогеном — тамоксифена цитратом — миллионов женщин, страдающих раком молочной железы, в 30—35 % случаев приводило к стойкой ремиссии и позволило снизить смертность на 20—25 %.

Совсем недавно изучался другой способ гормонотерапии — ингибирование тканевой продукции эстрадиола путем применения различных антиферментных агентов, участвующих в биосинтезе этого гормона. В настоящее время убедительно доказано позитивное влияние антиароматазных соединений при раке молочной железы [16, 17].

Известно, что «сульфатазный путь» особенно важен для внутритканевого образования эстрадиола в гормонозависимых карциномах молочной железы или в моделях рака молочной железы [9, 11]. Активность эстрон—сульфатазы потенциально значима, так как является основным фактором, контролирующим продукцию неконъюгированных эстрогенов из высоких концентраций сульфоконъюгированных предшественников, преобладающих в опухолевых тканях молочной железы, особенно у женщин в постменопаузе [9].

Представленные данные показали, что синтетический прогестаген дидрогестерон и его 20—ди— гидро—метаболит могут уменьшать конверсию эстрона сульфата в эстрадиол в гормонозависимых MCF—7 и T—47D клетках рака молочной железы, блокируя «сульфатазный путь». В клетках MCF—7 дигидро—дидрогестерон был существенно более активен, чем его предшественник дидрогестерон. Следует отметить, что ингибирование наблюдалось уже при очень низких концентрациях (5 х 10^—9 М) этого метаболита. Эти данные подтверждают, что и в исследованиях, и при лечении различными прогестагенами уместно исследовать биологическую активность их метаболитов. Влияние 20—дигидро—деривата на блокирование «сульфатазного пути» оказалось более выраженным, чем у дидрогестерона также и в клетках T—47D.

Активность 17β—ГСД в опухоли молочной железы (в исследованиях in vivo и in vitro) преимущественно проявляется при образовании эстрадиола из эстрона. 17р—ГСД—1 локализуется в цитоплазме злокачественных эпителиальных клеток опухолей молочной железы [18]. Отмечалось, что ориентация активности энзимов (оксидазная или редуктазная) при раке молочной железы также в большой степени зависит от локальных, метаболических или экспериментальных условий, включающих следующее: природу и концентрацию кофакторов (например, НАДФ или НАД) и субстрата, pH и субклеточную локализацию ферментов. Исследования in vitro с применением гомогенатов опухоли человека показали, что оксидазная активность 17β—ГСД преобладала над редуктазной [7]. Однако исследования in vivo после инфузии эстрогенов, меченых изотопами, у пациенток в постменопаузе с раком молочной железы показали, что редуктазная активность преобладает над оксидазной [19]. В гормонозависимых линиях клеток рака молочной железы (MCF—7, T—47D, R—27, ZR—75—1) преобладала редуктазная изоформа 17β—ГСД—1, но также были обнаружены изоформы 2 и 4 типов с оксидазной активностью (образование эстрона) [18, 20—22].

В представленном исследовании как дидрогестерон, так и его 20—дигидро—метаболит были способны блокировать редуктазную активность 17β—ГСД в клетках T—47D рака молочной железы, значительный эффект наблюдался даже при низких концентрациях этих прогестагенов (5 х 10^—9 М—5 х 10^—7М).

Таким образом, мы полагаем, что дидрогестерон и его 20—дигидро—метаболит действуют как селективные модуляторы эстрогенных энзимов (СМЭЭ). Представленные данные подтверждают, что и в исследованиях, и при лечении с использованием различных прогестагенов имеет смысл исследовать биологическую активность их метаболитов. Так, в клетках T—47D влияние 20—дигидро—метаболит на блокирование «сульфатазного пути» было более выражено по сравнению с дидрогестероном.

В заключение отметим, что дидрогестерон и его 20—дигидро—метаболит являются мощными ингибиторами активности сульфатазы и 17β—ГСД в клетках рака молочной железы, что приводит к снижению тканевых концентраций эстрадиола. Эти данные открывают интересные перспективы изучения и использования этих прогестагенов в клинических испытаниях у пациенток с раком молочной железы.

 

^{1 * Оригинальная публикация статьи: © Anticancer Research. — 2004. — N 24. — Р. 1433—1438.}

^{2 ** В. Прохорова. Редактор перевода на русский язык. НИИ АГ им. Д.О. Отта РАМН}

^{3 Конфлюэнтность — стадия развития клеточной культуры, когда клетки теряют способность к делению (Прим. ред.).}

About the authors

Н. Н. Thole

Solvay Pharmaceuticals GmbH

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Germany, Hanover

G. S. Chetrite

Institut de Puericulture

Email: info@eco-vector.com

Hormones & Cancer Research Unit

France, Париж

G. S. Philippe

Institut de Puericulture

Email: info@eco-vector.com

Hormones & Cancer Research Unit

France, Париж

J. R. Pasqualini

Institut de Puericulture

Email: info@eco-vector.com

Hormones & Cancer Research Unit

France, Париж

References

Supplementary files