Nucleic acid sequence—based amplification (nasba) and its application in obstetrical and gynecological practice

Full Text

Введение

Последние достижения молекулярной биологии сделали возможной разработку чувствительных, специфичных, быстрых и высокотехнологичных методов микробиологической диагностики, основанных на анализе нуклеиновых кислот. Эти методы обеспечивают амплификацию минимального количества нуклеиновых кислот, позволяя тем самым выявить генетический материал микроорганизма в концентрации, намного меньшей нижнего предела детекции традиционных микробиологических тестов, что крайне важно при тестировании небольшого количества клинического материала, особенно у новорожденных детей. К числу таких методов относится основанная на транскрипции амплификация нуклеиновых кислот (NASBA) (Nucleic Acid Sequence—Based Amplification) [5], которая все более широко применяется в молекулярной микробиологии, и особенно эффективно этот метод используется для выявления РНК. В основе метода NASBA лежит обнаружение специфического фрагмента нуклеиновой кислоты с помощью двух специфических праймеров и трех ферментов: обратной транскриптазы (ревертазы) вируса миелобластоза птиц (avian myeloblastosis virus — AMV), РНКазы H Escherichia coli и РНК—полимеразы фага Т7. В данном обзоре изложен принцип метода NASBA и описаны этапы анализа с его применением, а также обозначены основные направления его развития и приведены примеры применения метода в диагностической практике. Кроме того, дана сравнительная оценка метода NASBA и двух других методов амплификации нуклеиновых кислот, широко используемых в диагностике инфекционных заболеваний, — полимеразной цепной реакции (ПЦР) и обратнотранскриптазной ПЦР (ОТ—ПЦР).

Принцип метода

Реакция протекает при фиксированной температуре (41 °C): при участии AMV—ревертазы, РНКазы Н, Т7 РНК—полимеразы и двух специфических праймеров происходит экспоненциальная амплификация нуклеиновых кислот, результатом чего является накопление миллиардов копий РНК. Схема реакции представлена на рис. 1. После короткого периода инкубации при 65 °C, необходимого для денатурации РНК—мишени, специфический праймер (Р1) гибридизуется с РНК. Кроме последовательности, комплементарной PHК—мишени, этот праймер содержит также промоторную последовательность Т7 РНК—полимеразы.

 

Рис. 1. Схема реакции NASBA

 

При температуре 41 °C AMV—ревертаза удлиняет этот праймер, создавая ДНК—копию с РНК—матрицы и формируя гибрид РНК/кДНК. РНКаза Н воспринимает этот гибрид как субстрат и гидролизует РНК, оставляя однонитевую ДНК, с которой гибридизуется второй праймер (Р2). В результате удлинения этого праймера AMV ревертазой до 5’—конца кДНК формируется двунитевая ДНК, что приводит промотор Т7 РНК— полимеразы в функциональное состояние. Распознавая свой промотор, Т7 РНК—полимераза производит множество копий РНК, комплементарных исходной последовательности РНК. После этой «линейной» фазы, NASBA вступает в «циклическую» фазу. Праймер Р2 гибридизуется с вновь синтезированной молекулой РНК, и, по мере удлинения   этого праймера, РНКаза Н расщепляет РНК часть образующегося гибрида РНК/кДНК. Затем праймер Р1 связывается с кДНК, после чего AMV— ревертаза удлиняет его, а Т7 РНК—полимераза синтезирует новую РНК, запуская тем самым новый цикл. Данный механизм обеспечивает продукцию множества копий РНК с РНК—мишени.

Первоначально предполагалось, что в тех условиях, которые используются для амплификации РНК, ДНК не может служить мишенью в реакции NASBA, потому главным образом, что двунитевая ДНК не денатурируется при температуре 65 °C. Для того, чтобы ДНК могла служить мишенью в реакции NASBA, в начале анализа проводят два дополнительных шага денатурации ДНК при 95 °C. ДНК может амплифицироваться в реакции NASBA без введения дополнительных шагов денатурации, если праймеры подбираются либо к участкам ДНК с низкой температурой плавления, либо к однонитевым фрагментам ДНК. В этих условиях амплификация ДНК возможна, но только в случае отсутствия соответствующей последовательности РНК или существенного преобладания (> 1000) ДНК над РНК.

Таким образом, правильный выбор условий реакции обеспечивает NASBA уникальной способностью избирательно амплифицировать специфическую последовательность РНК в присутствии идентичной последовательности ДНК, входящей в состав двунитевой молекулы.

Основные этапы анализа

Анализ биологического материала с использованием метода NASBA состоит из трех основных этапов:

• выделение нуклеиновых кислот;
• амплификация специфического фрагмента РНК/ДНК;
• анализ продуктов амплификации.

Для выделения нуклеиновых кислот в настоящее время широко применяется метод, впервые описанный R. Boom и соавт. [4]. В основе метода лежит сорбция нуклеиновых кислот частицами диоксида кремния (силики) в присутствии хаотропного агента гуанидина изотиоцианата (GuSCN) высокой концентрации. Денатурирующие свойства GuSCN обеспечивают лизис клеток, эукариотических и бактериальных, и вирусных частиц, а также инактивацию РНКаз и ДНКаз, присутствующих в биологическом материале. Кроме того, благодаря нескольким отмывочным шагам, в ходе процедуры удаляются потенциальные ингибиторы реакции [15]. Метод успешно используется для выделения нуклеиновых кислот из цельной крови, плазмы, сыворотки, мочи, спинномозговой жидкости, генитальных мазков и другого клинического материала [27, 34].

При выборе праймеров для реакции NASBA руководствуются рядом правил, которые приведены в работах В. Deiman и соавт. и R. Sooknanan и соавт. [9, 35].

До проведения этапа денатурации готовят реакционную смесь, в которую входят все компоненты реакции, кроме ферментов. Состав реакционной смеси, условия реакции и этапы ее оптимизации приводятся в работе D. van Strijp и соавт. [36]. После денатурации мишени и ее гибридизации с праймером Р1 в реакционную смесь добавляется смесь ферментов. Амплификация протекает при температуре 41 °C в течение 1—2 часов; кинетика реакции в основном определяется эффективностью связывания праймеров. С разработкой стандартного базового набора NucliSens Basic Kit (Organon Teknika), в состав которого входят все реагенты, кроме специфических праймеров и зондов, оптимизация анализа и его процедура существенно упростились.

Последний этап процедуры анализа — детекция продуктов NASBA. Однонитевая РНК, амплифицируемая в ходе реакции, является очень удобным материалом для реализации гибридизационных схем детекции. В литературе описано несколько методов анализа РНК—ампликонов с помощью олигонуклеотидных зондов. Так, В.М. Darke и соавт. [8] применили методику «enzyme linked gel assay» (ELGA), в которой используются олигонуклеотиды, меченые пероксидазой хрена. Свободные и связавшиеся с ампликонами зонды разделяют методом электрофореза в геле, содержащем сульфат декс—трана, после чего их можно визуализировать путем инкубации геля с субстратом пероксидазы хрена. F. Oehlenschlager и соавт. для детекции продуктов NASBA успешно применили зонды, меченые флюоресцентными красителями [30]. Однако самое широкое распространение получила электрохемилюминисцентная детекция (ECL — electrochemiluminiscenf) — методика, в которой используются олигонуклеотидные зонды, меченые хелатом рутения [11]. Так, в коммерческой системе NucliSens Basic Kit (Organon Teknika) для реализации ECL—формата детекции используются два олигонуклеотидных зонда. Один из зондов (зонд «захвата»), комплементарный последовательности ампликона, метят биотином и прикрепляют к магнитным частицам, покрытым стрептавидином. Второй зонд (ECL—зонд), меченый хелатом рутения, является общим для всех ампликонов, так как он комплементарен нуклеотидной последовательности, добавленной к З'—концу праймера Р2 и одинаковой для всех праймеров. Индуцируемая электрическим напряжением окислительно—восстановительная реакция приводит к возникновению электрохемилюминисцентного сигнала, который усиливается, а затем регистрируется фотоумножителем.

Основное направление развития метода NASBA, как и всех молекулярных диагностических методов, — стандартизация и автоматизация процедуры анализа в целях повышения эффективности его использования в рутинной лабораторной диагностике. С тех пор как метод NASBA был впервые описан, этап детекции продуктов реакции постоянно совершенствовался, однако все предложенные методики требовали значительных затрат труда, времени и/или использования дополнительных дорогостоящих приборов. Недавно для детекции продуктов NASBA была применена технология молекулярных биконов (beacon — сигнал, маяк), которая широко используется в современной модификации ПЦР—анализа — ПЦР в реальном времени. Молекулярный бикон представляет собой олигонуклеотидный зонд, к 5’—кон— цу которого присоединен флюорофор, а к З’—концу — «гаситель». Первые 6—7 нуклеотидов зонда комплементарны последним 6—7 нуклеотидам, а внутренняя последовательность комплементарна ампликону. В отсутствие мишени нуклеотидная последовательность З’—конца гибридизуется с последовательностью 5’—конца, образуя так называемый «стебель», после чего флюорофор и «гаситель» оказываются в непосредственной близости друг от друга, и энергия, выделяемая флюорофором, поглощается «гасителем». В присутствии мишени внутренняя последовательность бикона, образующая «петлю», гибридизуется с ней, зонд «раскрывается», в результате чего флюорофор и «гаситель» удаляются друг от друга, а испускаемый флюорофором свет регистрируется прибором (рис. 2). Увеличение флюоресценции, отражающее динамику накопления продуктов реакции, отображается на дисплее прибора: таким образом, детекция ампликонов осуществляется по мере их накопления в режиме реального времени. Отсутствие этапа детекции существенно укорачивает время анализа и снижает риск контаминации. Кроме того, NASBA в реальном времени позволяет точно и быстро определить количество копий мишени в клинической пробе. Так, для количественного анализа мишени в ECL—формате используются 3 калибратора — фрагмента РНК, фланкируемых теми же праймерами, но имеющих отличную от мишени внутреннюю последовательность, — каждый из которых добавляется в реакционную смесь в определенной концентрации. После амплификации проводится гибридизация с 4 различными зондами (один зонд комплементарен исследуемой матрице, остальные — калибраторам), и по ECL—сигналам калибраторов рассчитывается исходная концентрация мишени [11, 26]. При использовании молекулярных биконов необходим только один калибратор — амплификация и детекция исследуемой матрицы и калибратора осуществляются одновременно, после чего кинетика обеих реакций используется для расчета концентрации мишени [40].

 

Рис. 2. Схема действия молекулярного бикона: Ф — флюорофор, Г — «гаситель»

 

Впервые применение молекулярных биконов для анализа продуктов NASBA было описано G. Leone и соавт. [22]. С тех пор данный подход был успешно применен для выявления РНК—вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) [1], цитомегаловируса (ЦМВ) [13], вируса папилломы человека (ВПЧ) [7].

Области применения

С помощью метода NASBA можно амплифицировать различные виды РНК: мРНК, рРНК, а также геномную РНК РНК—содержащих вирусов. Основными областями применения этого метода являются диагностика инфекций, вызванных РНК—содержащими вирусами, изучение экспрессии бактериальных и вирусных генов, а также диагностика бактериальных и грибковых инфекций, которая основана на выявлении 16S и 18S рРНК, соответственно.

Применение метода NASBA для диагностики ВИЧ впервые было описано в 1994 году, и уже в 1995 году появилась первая коммерческая тест— система для выявления и количественной оценки РНК ВИЧ методом NASBA [11]. Дальнейшее развитие метода привело к созданию тест—системы второго поколения, позволяющей с высокой точностью определить количество вируса в очень широком диапазоне концентраций — от 25 до 5х10⁶ копий РНК в 1 мл плазмы крови [29]. Наконец, применение технологии молекулярных биконов позволило создать тест—систему, с помощью которой можно провести количественный анализ РНК ВИЧ в 48 пробах в течение 90 минут [1].

Очень широко применяется метод NASBA и для диагностики гепатита С (ВГС). F. Lunel и соавт. [24], сравнивая три коммерческие тест— системы для количественного определения РНК ВГС, использующие методы ОТ—ПЦР (Amplicor HCV Monitor, Roche), NASBA (NASBA HCV, Organon) и метод амплификации сигнала bDNA (branched DNA) (Quantiplex HCV RNA, Chiron), показали, что самой высокой чувствительностью обладал метод NASBA (99 % при 94 % для ОТ—ПЦР и 88 % для bDNA). Что касается воспроизводимости результатов, то метод ОТ—ПЦР уступал методам NASBA и bDNA. Возможности применения NASBA для количественного анализа ВГС с одновременным определением его генотипа были продемонстрированы R. Melsert и соавт. [26]. В качестве примеров использования NASBA для диагностики других РНК—содержащих вирусов можно привести выявление вируса парагриппа [16], ротавируса [18] и энтеровирусов [10, 21].

Экспрессия некоторых генов клинически значимых вирусов может служить специфическим индикатором их репликации и использоваться в диагностических целях. Так, по мнению многих авторов, экспрессия предранних генов ЦМВ в лейкоцитах крови может рассматриваться как первый признак активной цитомегаловирусной инфекции (ЦМВИ), хотя выявление транскриптов предранних генов не всегда предсказывает клинически значимую инфекцию. В то же время экспрессия поздних генов ЦМВ может прогнозировать диссеминацию вируса и развитие заболевания [3, 12, 14, 31]. Для выявления транскриптов позднего гена ЦМВ UL65, кодирующего капсидный белок рр67, методом NASBA была разработана коммерческая тест—система (NucliSence CMV рр67, Organon Teknika), с помощью которой диагностировали клинически значимую ЦМВИ у пациентов, перенесших трансплантацию различных органов и костного мозга [3, 12], а также пациентов, инфицированных ВИЧ [41]. Перспективы использования метода NASBA для диагностики врожденной ЦМВИ обрисовали М. Revello и соавт. [32, 33]. Они показали, что определение транскриптов предраннего гена IE1 ЦМВ в лейкоцитах крови может служить методом ранней диагностики первичной ЦМВИ у беременных женщин и врожденной ЦМВИ у новорожденных детей [32]. Так, IE1 мРНК была выявлена в 100, 75, 36,3 и 22 % образцов крови, полученных от беременных женщин через 1, 2, 3 и 4—6 месяцев после инфицирования ЦМВ, соответственно. Ни у одной женщины с первичной ЦМВИ по истечении 6 месяцев после инфицирования транскрипты гена IE1 не выявлялись. У новорожденных детей с врожденной ЦМВИ IE1 мРНК была обнаружена в 100 % образцов крови, собранных через 1—7 дней после рождения (в среднем через 1,5 дня), и в 46,4% образцов крови, собранных через 27—260 дней после рождения (в среднем через 88 дней). При обследовании контрольной группы, состоящей из женщин с рецидивирующей ЦМВИ или ЦМВИ, перенесенной задолго до беременности, а также неинфицированных новорожденных детей, транскрипты гена IE1 не выявлялись. В более поздней работе эти авторы представили анализ данных, полученных при пренатальной диагностике ЦМВИ у 102 женщин с первичной инфекцией [33]. Образцы амниотической жидкости и крови плода были исследованы методами культуры клеток, ПЦР, NASBA, и, кроме того, кровь плода была протестирована на наличие антигенов ЦМВ и иммуноглобулинов класса М. Диагностические характеристики методов оценивались по отношению к врожденной ЦМВИ, диагностированной при рождении. В то время как все методы обладали очень высокой специфичностью и прогностической значимостью положительных результатов, чувствительность и прогностическая значимость отрицательных результатов сильно варьировала. Самые высокие показатели чувствительности были получены при выявлении ДНК—вируса в амниотической жидкости методом ПЦР (90,2 %) и РНК — методом NASBA (90,9 и 90,3 % для мРНК генов IE1 и UL65, соответственно), самые низкие — при определении иммуноглобулинов класса М в крови плода (52,5 %) и выделении вируса из крови плода в культуре клеток (38,2 %). В соответствии с этим распределились и показатели прогностической значимости отрицательных результатов: при выявлении ДНК ЦМВ в амниотической жидкости методом ПЦР данный показатель равнялся 90,4%, при выявлении мРНК генов IE1 и UL65 методом NASBA — 93,2 и 93,3 %, соответственно, при определении IgM в крови плода — 69,3 % и выделении вируса из крови плода в культуре клеток — 64,4 %. Результаты работы позволили авторам заключить, что анализ мРНК как предранних (IE1), так и поздних (UL65) генов ЦМВ с помощью NASBA в амниотической жидкости является надежным методом пренатальной диагностики ЦМВИ и может использоваться для подтверждения результатов ПЦР, особенно в случае отсутствия возможностей для культивирования вируса [33].

Применение метода NASBA для изучения экспрессии онкогенных белков Е6 и Е7 вируса папилломы человека (ВПЧ) описано в работах I. Kraus и соавт. [20] и К. Cuschieri и соавт. [7]. I. Kraus и соавт. исследовали на наличие ДНК ВПЧ и мРНК генов Е6 и Е7 ВПЧ высокого онкогенного риска (16, 18, 31, 33, 45, 52 и 58 типов) 190 биопсийных проб из цервикального канала, полученных от женщин с дисплазией шейки матки, которым было назначено оперативное лечение методом конизации шейки [20]. Они показали, что частота выявления ДНК и РНК ВПЧ увеличивалась со степенью дисплазии, и практически во всех случаях дисплазии высокой степени были выявлены транскрипты генов Е6 и Е7 ВПЧ. В работе К. Cuschieri и соавторов было показано, что выявление транскриптов генов Е6 и Е7 онкогенных типов ВПЧ в клиническом материале ассоциировано с повышенным риском цервикальной неопластической прогрессии, и персистенция РНК вируса может быть лучшим прогностическим индикатором, чем персистенция ДНК [7]. Они наблюдали течение папилломавирусной инфекции (ПВИ), установленной по наличию ДНК ВПЧ, у 54 женщин с неизмененной морфологией эпителиальных клеток шейки матки в начале наблюдения. Через два года материал от этих женщин снова исследовали на ДНК ВПЧ. Кроме того, материал, полученный в обеих временных точках, с помощью NASBA проанализировали на наличие мРНК генов Е6 и Е7 ВПЧ 16, 18, 31, 35 и 45 типов. У 11 из 54 женщин (20 %) за два года развились диспластические изменения. Результаты генотипирования ВПЧ показали, что у 31 из 54 (57 %) женщин имела место транзиторная ПВИ, тогда как у 23 женщин (43 %) наблюдалась типоспецифическая персистенция вируса, и в этих случаях вероятность развития дисплазии эпителия шейки матки была значительно выше (Р=0,001), чем в случаях транзиторной ПВИ. Кроме того, если транскрипты генов Е6 и Е7 были обнаружены уже в начале наблюдения, вероятность персистенции вируса была значительно выше (Р=0,013), чем в тех случаях, когда в начале наблюдения обнаруживали только ДНК ВПЧ. Авторы работы подчеркнули важность определения типоспецифической персистенции ПВИ для выявления женщин с повышенным риском развития диспластических изменений эпителия шейки матки. В качестве инструмента, по мнению авторов, может использоваться анализ ДНК ВПЧ с последующим генотипированием, проводимый через определенные промежутки времени. Альтернативным методом может служить выявление Е6/Е7 мРНК с помощью NASBA — в этом случае исследование может выполняться в одной временной точке.

По сравнению с методом ОТ—ПЦР, который широко используется для диагностики РНК—вирусов и изучения экспрессии генов, метод NASBA обладает рядом преимуществ. По данным разных авторов, чувствительность NASBA превышает чувствительность ОТ—ПЦР в 10—100 раз [17, 39]. Принцип метода NASBA таков, что амплифицируется только РНК; «фоновая» ДНК может служить мишенью только при определенных условиях, о которых говорилось выше. Этим определяется важнейшее преимущество NASBA в области детекции и количественного анализа РНК: нет необходимости синтезировать кДНК и производить обработку ДНКазой для удаления «фоновой» ДНК, а также контролировать эффективность этих процессов.

Так как в активно размножающихся микроорганизмах 16S рРНК присутствует в большом количестве, она является идеальной мишенью для ранней диагностики бактериальных инфекций. Особенно эффективно применение NASBA для выявления бактериальных патогенов, культивирование которых связано с серьезными затратами труда и времени, таких как Chlamydia trachomatis [25, 27], Neisseria gonorrhoeae [25], Chlamydia pneumoniae [6], Mycoplasma pneumoniae [23], Campylobacter jejuni [37], различные виды микобактерий [38]. S. Moire и соавт. [28] при анализе материала от пациентов, получавших лечение доксициклином по поводу генитальной хламидийной инфекции, методами культуры клеток, ПЦР и NASBA пришли к выводу, что NASBA может применяться вместо культурального метода для оценки эффективности антимикробной терапии. Они исследовали цервикальные соскобы и пробы мочи, которые были получены от 25 женщин до лечения и в разные сроки (до 5 недель) после лечения. При анализе цервикальных соскобов 16S рРНК С. trachomatis была обнаружена во всех пробах до лечения и только в двух пробах, взятых через неделю после окончания лечения. В пробах, полученных через 2 недели после лечения и более, РНК хламидий не выявлялась. В противоположность этому ДНК хламидий была обнаружена в 21 из 25, в 6 из 21 и в 5 из 20 проб, полученных через одну, две и три недели после окончания лечения, соответственно. У 15 пациенток были взяты также пробы мочи. РНК хламидий была обнаружена во всех пробах до лечения, и только в одной из 15 проб, полученных через неделю после лечения, тогда как ДНК — в 4 из 15 проб. Ни ДНК, ни РНК хламидий не выявлялись в пробах мочи, полученных через две недели и более после окончания лечения. По сравнению с культуральным тестом NASBA обладает более высокой чувствительностью, и к тому же анализ методом NASBA занимает гораздо меньше времени.

Способность обнаруживать только жизнеспособные организмы определяет основное преимущество NASBA перед ПЦР при использовании ее в диагностике бактериальных и грибковых инфекций [2, 19]. Кроме того, так как в нормально развивающихся организмах содержание рРНК очень высоко, то в отдельных случаях чувствительность NASBA может превышать чувствительность ПЦР [27].

Учитывая, каким потенциалом обладает технология NASBA для применения в области молекулярной диагностики инфекций, в том числе инфекций, значимых для акушерства и гинекологии, можно утверждать, что в недалеком будущем этот метод займет достойное место в арсенале диагностических средств современной микробиологической лаборатории.

About the authors

Е. V. Shipitsyna

Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Saint Petersburg

О. V. Budilovskaya

Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Saint Petersburg

А. М. Savitcheva

Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files