Cytokine production by chorionic villous explant in case of preeclampsia under hypoxia

Full Text

Неясность этиологии, отсутствие единого взгляда на патогенез, непредсказуемость клинического течения - основные причины того, что поздний гестоз (ПГ) был и остается наиболее тяжелым осложнением беременности. Даже в развитых странах гестозом страдают до 7% беременных, и заболеваемость, несмотря на все успехи современного акушерства, не имеет тенденции к снижению.

Для объяснения причины развития ПГ было предложено большое количество различных теорий, зачастую противоречивых. После многочисленных исследований актуальными на сегодняшний день остались всего четыре: теория плацентарной ишемии, теория токсического воздействия липопротеинов очень низкой плотности, теория иммунной дезадаптации и теория генетической предрасположенности [5].

Наиболее доказанной считается теория плацентарной ишемии [3, 8]. Согласно основным ее положениям, важную роль играет нарушение плацентарного кровообращения. По современным данным, патология спиральных артерий матки, развившаяся в результате нарушения плацентации, приводит к локальной ишемии ворсинчатого хориона плаценты [6, 9], что сопровождается выработкой в этом участке медиаторов, вызывающих повреждение эндотелия, клинически проявляющееся гипертензией, протеинурией и отеками [4]. Среди веществ, способных реализовать синдром генерализованной эндотелиальной дисфункции, в последнее время все больший интерес привлекают цитокины, например, такие, как интерлейкин 1ß (MJI1ß) и туморнекроти- ческий фактор а (ТНФа). Их выработка in vitro синцитиотрофобластом и другими клетками хориальных ворсин, взятых из плацент здоровых родильниц, усиливается в состоянии гипоксии [2]. Цитокинпродуцирующая функция хориона в состоянии гипоксии как in vitro, так и in vivo определяется исходным состоянием активируемых клеток, которое, в свою очередь, отражает условия их существования в организме матери, степень реализации и резервы задействованных механизмов ответа на гипоксию. В таком случае продукция цитокинов в количественном отношении связана со степенью тяжести гестоза и зависит от того, в каком состоянии находилась плацента к моменту родов.

Для выяснения роли цитокинового обмена в патогенезе ПГ мы поставили перед собой задачу изучить, как в ответ на гипоксию меняется продукция культурой ворсин хориона указанных выше цитокинов, а также интерлейкина-4 (ИЛ4) и интерлейкина-6 (ИЛ6), взятых из плацент родильниц с ПГ различной степени тяжести.

Методы исследования

С целью исключения сочетанных форм ПГ на основании клинического обследования нами были выбраны 20 здоровых родильниц, 20 родильниц с легкой и 20 с тяжелой формой позднего гестоза. Общими критериями отбора служили: возраст от 18 до 30 лет, предстоящие первые срочные роды, отсутствие фоновой экстрагенитальной и гинекологической патологии, отсутствие осложнений беременности, не связанных с ПГ.

Здоровыми считались женщины, не имеющие любых клинических и лабораторных признаков ПГ, других осложнений беременности, родов и раннего послеродового периода.

Диагноз легкой формы ПГ выставлялся при наличии у беременной отеков, не исчезающих после 12-часового отдыха в горизонтальном положении; протеинурии 0,033-1,0%о в разовой пробе мочи; повышения систолического и диастолического АД после 20 недель беременности более чем на 15% по сравнению с исходным до беременности. Описанная клиническая картина соответствует нефропатии I.

Тяжелые формы ПГ, соответствующие нефропатии III и преэклампсии, диагностировались при присоединении к клинике легкой формы хотя бы одного из следующих признаков: устойчивого повышения систолического АД более 160 мм. рт. ст. или диастолического более 110 мм. рт. ст.; массивной протеинурии более 5%о за 24 часа; олигурии менее 500 мл/ сут; неврологической симптоматики в виде головной боли, боли в эпигастральной области, нарушений зрения; синдрома задержки развития плода.

Роды у всех женщин из групп здоровых и больных легкой формой ПГ закончились через естественные родовые пути рождением живых доношенных детей массой от 3000 до 4600 г. В группе больных тяжелыми формами ПГ 11 женщин были родоразрешены путем операции кесарева сечения, у 8 детей была диагностирована внутриутробная гипотрофия I-II степени.

Объектом исследования служила родившаяся плацента. Для подготовки образцов и моделирования воздействия гипоксии мы использовали модифицированную нами методику, описанную D.F. Вепуо, Т.М. Miles и К.Р. Conrad (1997). После удаления стволовых ворсин, децидуальной и амниотической оболочек хориальную ткань измельчали на кусочки массой 5-10 мг и промывали тремя сменами раствора Хенкса. После этого навеску измельченной ткани массой 500 мг гомогенизировали в фарфоровой ступке, из гомогената цитокины экстрагировали забуференным фосфатным буфером физиологическим раствором в соотношении 1:10 с последующим центрифугированием в течение 10 минут при 3000 об/ мин. Для исследования отбиралась надосадочная жидкость. Условия гипоксии создавались путем инкубации в течение 24 часов в термостате, разогретом до 37 градусов, при непрерывном встряхивании навески измельченной ткани массой 500 мг в герметично закрытой пластиковой пробирке, заполненной 3,5 мл среды 199 с добавлением 350 мкл инактивированной в течение 30 минут при 56 градусах сыворотки крови IV группы здоровых небеременных женщин и гентамицина в концентрации 60 мкг/мл. По завершении инкубации после промывания в 3-х сменах раствора Хенкса была произведена экстракция цитокинов по описанной выше методике.

В подготовленных образцах определялась концентрация HJI1ß, ИЛ4, ИЛ6 и ТНФа методом твердофазного иммуноферментного анализа наборами производства ТОО “Протеиновый контур”, г. Санкт-Петербург. Результаты считывались планшетным фотометром iEMS Reader MF производства фирмы Labsystems. Полученные данные обрабатывались с помощью двустороннего критерия Стъюдента в программе Primer of Biostatistics 4.03 для Windows’95 на IBM-совместимом компьютере. Достоверными считались различия при р<0,05.

Результаты исследования

Уровень ИЛ1р с высокой степенью достоверности различался во всех трех группах (табл. 1). Наименьшее количество цитокина отмечено у больных тяжелыми формами ПГ - от 342 до 606 пкг/г ткани; наибольшее - у здоровых женщин (741-887 пкг/г ткани).

 

Таблица 1. Содержание цитокинов в ворсинах хориона на момент родоразрешения

Цитокин	Здоровые, М+т (п=20)	Больные ПГ
		Легкая форма, М±т (п-20)	Тяжелые формы, М±т (п=.2О)
ИЛβ, пкг/г ткани	819±13	612±23***	484±22***###
ИЛ4, пкг/г ткани	1953±84	2438±144**	1687±65***#
ИЛ6, пкг/г ткани	1585±48	732±31***	1298±70***##
ТНФа, пкг/г ткани	4914±129	6586±150***	3369±149***###

Статистическая значимость различий с данными группы здоровых обозначена: **-р<0,01, ***-р<0,001.

Статистическая значимость различий с данными группы больных легкой формой ПГ обозначена: # -р<0,05, ## — р<0,01 и ### -р<0,001.

 

У больных легкой формой ПГ содержание ИЛ1ß колебалось от 482 до 683 пкг/г ткани.

Количество ТНФа в ворсинах хориона также было различным во всех трех группах с высокой степенью достоверности (табл.1). Высокий уровень цитокина отмечен в группе больных легкой формой ПГ (от 5892 до 6968 пкг/г ткани). Наименьшее содержание было у больных тяжелыми формами - 2656-4426 пкг/г ткани. У здоровых беременных количество ТНФа колебалось от 4091 до 5608 пкг/г ткани.

Концентрация ИЛ4 достоверно различалась во всех трех группах обследованных (табл. 1). Наибольшее количество отмечено у больных легкой формой ПГ - 1702-3206 пкг/г ткани; наименьшее - у больных тяжелой формой (1302-2153 пкг/г ткани). Среди здоровых пациенток уровень цитокина колебался от 1307 до 2271 пкг/г ткани.

Уровень ИЛ6 с высокой степенью достоверности различался во всех трех группах (табл. 1). Минимальное количество отмечено у больных легкой формой ПГ (от 501 до 862 пкг/г ткани). Максимальное содержание цитокина было у здоровых женщин (1294-1893 пкг/г ткани). В группе больных тяжелыми формами ПГ концентрация составляла от 834 до 1708 пкг/г ткани.

Наибольшее количество ИЛ1ф после воздействия гипоксии (табл. 2) определялось в ворсинах хориона плацент здоровых женщин (от 1297 до 3389 пкг/г ткани); наименьшее - у больных тяжелыми формами ПГ (221-351 пкг/г ткани). У больных легкой формой ПГ содержание HK1ß составляло от 827 до 1798 пкг/г ткани.

 

Таблица 2. Содержание цитокинов в ворсинах хориона после воздействия гипоксии

Цитокин	Здоровые, М±т (n=20)	Больные ПГ
		Легкая форма, М±m (n=20)	Тяжелые формы, М±m (n=20)
ИЛß, пкг/г ткани	2010±183	1150±81***	281±11***###
ИЛ4, пкг/г ткани	5333±241	10410±264***	16149±231*###
ИЛ6, пкг/г ткани	6298±225	5614±219*	10250±177***###
ТНФа, пкг/г ткани	6623±94	4657±96***	1549±79***###

Статистическая значимость различии с данными группы здоровых обозначена: *-р<0,05, ***-р<0,001.

Статистическая значимость различий с данными группы больных легкой формой ПГ обозначена: ### — р<0,001.

 

Максимальная концентрация ИЛ4 после воздействия гипоксии (табл. 2) отмечена у больных легкой формой ПГ - от 8861 до 12406 пкг/г ткани. Минимальным количество было у здоровых женщин (4188-6689 пкг/г ткани). У больных тяжелыми формами ПГ содержание ИЛ4 было ненамного больше, чем у здоровых беременных, - от 4944 до 7713 пкг/г ткани.

Самым большим уровень ИЛ6 после воздействия гипоксии был у больных тяжелыми формами ПГ (8943-11134 пкг/г ткани). Наименьшая концентрация цитокина отмечена у больных легкой формой ПГ - от 4062 до 6706 пкг/ г ткани. У здоровых женщин ИЛ6 содержался в количестве от 5242 до 8006 пкг/г ткани.

Уровень ТНФа после воздействия гипоксии был наибольшим у здоровых женщин - от 6103 до 7071 пкг/г ткани, наименьшим - у больных тяжелыми формами ПГ (1057-2003 пкг/г ткани). В ворсинах хориона больных легкой формой ПГ содержание цитокина составило от 4112 до 5206 пкг/ г ткани.

Таким образом, воздействие гипоксии привело к значительным изменениям содержания цитокинов в ворсинах хориона по сравнению с неинкубированной тканью.

Количество MH1ß в группе здоровых и больных легкой формой ПГ возросло, причем у здоровых величина различия была достоверно больше. В группе больных тяжелыми формами ПГ его концентрация, наоборот, снизилась.

Содержание ИЛ4 в несколько раз возросло во всех трех группах. При этом в группе больных легкой формой ПГ количество цитокина возросло более чем в 4 раза.

Концентрация ИЛ6 также увеличилась во всех трех группах, особенно у больных ПГ. Разница между нативной и инкубированной в условиях гипоксии тканью у больных тяжелыми формами ПГ составила больше чем 8 раз.

Уровень ТНФа у здоровых под действием гипоксии увеличился, а у больных ПГ снизился, причем в большей степени у больных тяжелыми формами ПГ.

Обсуждение

Исследованный нами процесс изменения продукции цитокинов в ответ на гипоксию является одним из звеньев реакции ворсинчатого хориона на это патологическое состояние. Одной из первых реакций тканей и клеток млекопитающих на воздействие гипоксии является выработка эритропоэтина - цитокина с выраженным действием на стволовые клетки костного мозга, таким образом увеличивающего эритропоэз. Установлено, что с участком гена, инициирующим транскрипцию эритропоэтина в ответ на гипоксию, практически идентичную последовательностъ кодонов в цепи ДНК имеют участки генов некоторых цитокинов, таких, например, как ТНФа и ИЛ1. Они, наряду с эритропоэтином, включены в список веществ, экспрессия генов которых регулируется парциальным давлением кислорода [2, 4].

Описанные показатели цитокинового обмена в ворсинах хориона после воздействия гипоксии демонстрируют наличие нескольких фаз в изменении продукции цитокинов под влиянием этого патологического фактора.

Первая фаза изменений наблюдается при воздействии гипоксии на ткань здорового хориона и отмечается при инкубации в условиях гипоксии ворсин хориона здоровых женщин. В этот период возрастала продукция всех описанных цитокинов по сравнению с интактной тканью.

Вторая фаза имеет место при более длительном воздействии гипоксии и обнаруживается при инкубации в состоянии гипоксии ворсин хориона больных легкой формой ПГ. Продукция HJI1ß и ТНФа уменьшается под воздействием увеличившегося синтеза ИЛ4 [4]. Количество ИЛ6 существенно не изменяется.

Во время третьей фазы в результате нарастающего воздействия гипоксии, как это было продемонстрировано у больных тяжелыми формами ПГ, содержание HJI1ß и ТНФа резко уменьшается, ограничивающая роль ИЛ4 ослабевает, уступая место ИЛ6, количество которого в эту фазу резко возрастает [1].

Эти изменения цитокинового обмена подтверждают реализацию первичного ответа ткани на воздействие гипоксии при участии ИЛ1ф и ТНФа, а также наличие ограничивающего воздействия таких цитокинов, как ИЛ4 и ИЛ6, на продукцию своих предшественников и доминирование этих цитокинов при адаптационных процессах в ходе длительного воздействия патологического фактора - гипоксии.

Вывод

Повышение количества одних цитокинов и снижение синтеза других в синцитиотрофобласте хориальных ворсин направлено на перестройку межклеточных взаимоотношений, которая должна подготовить ворсины хориона к работе в условиях пониженного содержания кислорода, а также повысить проницаемость плацентарного барьера с целью адекватного снабжения плода.

Постоянный контакт ворсин хориона с кровью матери позволяет цитокинам легко попадать в системный кровоток и оказывать воздействие на эндотелий сосудов матери, вызывающий повышение их проницаемости и синдром генерализованной эндотелиальной дисфункции - основной эффект ПГ.

About the authors

A. Ju. Krivoruchko

Stavropol State Medical Academy

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Stavropol

V. A. Aksenenko

Stavropol State Medical Academy

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Stavropol

A. N. Kvochko

Stavropol State Medical Academy

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Stavropol

R. V. Pavlov

Stavropol State Medical Academy

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Stavropol

References

Supplementary files