Коррекция нарушений гемостаза у самок с экспериментальным гестозом с помощью производных ГАМК

Полный текст

Гестоз — это довольно частое осложнение беременности (12–40 % случаев), возникающее и развивающееся при остром повреждении эндотелия сосудов и мембран эритроцитов и тромбоцитов, вследствие чего нарушаются реологические и коагуляционные свойства крови, увеличивается ее тромбогенная активность [1, 8, 12, 14, 15]. Применяющиеся в настоящий момент в клинике антикоагулянты и антиагреганты обладают рядом неблагоприятных побочных действий и, в некоторых случаях, недостаточной эффективностью [1]. Поэтому поиск веществ с антикоагулянтной и антиагрегантной активностью для лечения нарушений в системе гемостаза при осложненной беременности остается актуальным. Известно, что производные гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) снижают агрегацию эритроцитов и тромбоцитов, ограничивают гиперкоагуляцию плазмы, улучшают реологию и микроциркуляцию крови [5, 8, 6, 13]. В этой связи целью данного исследования явилось изучение влияния производных ГАМК на показатели гемостаза при экспериментальном гестозе. Материалы и методы Существует несколько моделей воспроизведения экспериментального гестоза (ЭГ) у животных: путем коарктации аорты, введением DOCA (дезоксикортикостерона) и 0,9 % солевого раствора, использованием ингибитора NO-синтазы нитро-L-аргинина, заменой питьевой воды на 1,8 % NaCl и др. [9, 18, 19, 17, 16, 20]. По данным литературы, при использовании этих моделей наблюдаются эффекты, сходные с развитием гестоза: гипертензия, протеинурия, активация ренин-ангиотензин-альдостероновой системы, снижение маточно-плацентарного кровотока, эндотелиальная дисфункция, гиперкоагуляция, нарушения баланса гормонов фето-плацентарного комплекса, задержка внутриутробного развития плодов и др. Нами была выбрана легко воспроизводимая модель экспериментального гестоза — замена питьевой воды на 1,8 % р-р NaCl у беременных самок с 1-го дня гестации и до родов [9, 18, 19]. Эксперименты проведены на беременных беспородных крысах-самках массой 220–250 г. Первый день гестации определялся по наличию сперматозоидов во влагалищном мазке. Развитие осложнения беременности определялось триадой симптомов, характерных для гестоза: повышение артериального давления (АД), протеинурия, выраженность отечного синдрома. Измерение артериального давления проводилось у бодрствующих беременных крыс в первый и последний дни гестации с использованием компьютерной системы Power Lab/4SP с ML135 Dual Bio и MLA0112 ECG Lead Swich Box. Для измерения АД самка помещалась в домик, на хвост одевался манжет и датчик, после чего производилось измерение. Определение концентрации белка в суточной моче осуществлялось фотометрически (спектрофотометр ПЭ –5400 В («Экрос» Россия)) по реакции с пирогаллоловым красным (набор реагентов «Ольвекс диагностикум», Россия) до и на 20-й день беременности. Для сбора мочи беременные самки помещались в метаболические камеры («Евролаб», Россия). Результаты концентрации белка рассчитывались согласно формуле: С = С станд* D образец/D станд, где С станд — концентрация белка в калибровочном растворе, D станд. и D образец — оптическая плотность стандартной и опытной проб на длине волны 600 нм, полученный результат умножался на суточный диурез животного. Для определения наличия отечного синдрома у декапитированных животных забирались кусочки жировой, мышечной тканей и мозга, инкубировались в термостате при t = 37 °С в течение 24 часов, по разнице массы препаратов до и после инкубации судили о степени выраженности отеков. Изучено влияние производных ГАМК — соединений под лабораторными шифрами РГПУ-189 в дозе 15 мг/кг (n = 6), РГПУ-147–50 мг/кг (n = 6) и препарата сравнения сулодексида — 30 МЕ/кг (n = 6) на показатели гемостаза в условиях экспериментального гестоза (ЭГ). Исследуемые вещества вводились перорально, один раз в сутки ежедневно с 1 до 20 дня гестации. Группой позитивного контроля служили беременные самки, принимавшие обычную воду (n = 6), в группу негативного контроля входили беременные самки с экспериментальным гестозом (n = 7), получавшие физ. р-р в аналогичном с опытными группами режиме. Забор крови для исследования гемостаза проводился из брюшного отдела аорты беременных крыс с экспериментальным гестозом на 20-й день гестации. Кровь стабилизировали 3,8%-м раствором цитрата натрия в соотношении 9 : 1. Определение показателей осуществлялось на программируемом оптико-механическом коагулометре — Минилаб 701 с использованием наборов для определения протромбинового времени, тромбин-теста, фибриноген-теста, активированного частичного тромбопластинового времени (производство НПО РЕНАМ, Россия) [2]. Антиагрегантная активность исследовалась на двухканальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов (модель 220 LA) научно-производственной фирмы «Биола» (г. Москва, Россия) по методу Born G. В модификации Габбасова З. А. и соавт. (1989) [10]. В качестве индуктора агрегации тромбоцитов использовали АДФ («Renal», Венгрия) в конечной концентрации 5 мкМ. Статистическую обработку результатов проводили в электронной таблице Exel 5.0 с использованием t-критерия Стьюдента, q-критерия Ньюмена-Кейлса при помощи пакета статистических программ Microsoft Exel 2006. Статистически достоверными различия считали при значимости р < 0,05. Результаты исследования У самок, получавших во время беременности обычную воду, артериальное давление к 20-му дню гестации не изменялось, концентрация белка в моче увеличивалась в 1,4 раза по сравнению с исходными показателями. Масса препаратов мозга, мышц и сальника снижалась после инкубации при 37 °С в течение 24 часов на 69,7; 73,8 и 17 % соответственно (табл. 1). В группе самок, принимавших во время беременности вместо питьевой воды 1,8 % р-р NaCl, на 20-й день гестации наблюдалось повышение АД на 18,2 %, увеличение концентрации белка в моче в 6,2 раза по сравнению с исходными данными, уменьшение массы препаратов мозга, мышц и сальника на 74,6; 76,3; 25,3 % соответственно (табл. 1). Полученные результаты свидетельствуют о выраженном повышении АД, белка в моче и отека тканей, что указывает на развитие экспериментального гестоза у животных этой группы, что согласуется с литературными данными [9, 18]. Самки, получавшие во время беременности вместо питьевой воды 1,8 % р-р NaCl и производные ГАМК — соединения РГПУ-147 и РГПУ-189, а также препарат сравнения сулодексид перорально, один раз в день ежедневно уменьшали выраженность экспериментального гестоза, о чем свидетельствует отсутствие изменений АД, снижение концентрации белка в моче и отеков у животных опытных групп по сравнению с контрольной группой с ЭГ (табл. 1). Исследование гемостаза показало, что в контрольной группе животных с осложненной беременностью наблюдается укорочение активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) на 14,6 % (р < 0,05) по сравнению с показателем группы беременных самок без ЭГ (табл. 2), что свидетельствует об активации процессов свертывания крови. АЧТВ у животных с ЭГ, получавших во время гестации соединения РГПУ-189, РГПУ-147 и сулодексид, увеличилось на 24,1; 20,3; 59,5 % (р ≤ 0,05) соответственно, по сравнению с группой позитивного контроля, что позволяет предположить наличие у них антикоагулянтных свойств (табл. 2). Протромбиновое время (ПВ) у самок с осложненной беременностью уменьшилось по сравнению с аналогичным показателем животных группы позитивного контроля на 15,3 % (р ≤ 0,05), что отражает активацию внешнего пути образования тромбина на фоне моделируемой патологии. Введение животным с ЭГ соединения РГПУ-189 повышало ПВ на 32,2 %, РГПУ-147 — на 49,3 % (р ≤ 0,05), сулодексида — 40,2 на % (р ≤ 0,05) (табл. 2). О преобладании процессов гиперкоагуляции при ЭГ свидетельствует также укорочение тромбинового времени, которое наблюдалось у животных группы негативного контроля (13,5 ± 4,02 сек) по сравнению с самками с неосложненной беременностью (21,8 ± 4,4) (р < 0,05). Введение соединений РГПУ-147, РГПУ-189 и препарата сравнения сулодексида беременным самкам с ЭГ, приводило к удлинению ТВ на 30,1; 17,1; 52,4 % соответственно, по сравнению с группой негативного контроля (табл. 2). По результатам проведенного исследования в группе животных с осложненной беременностью наблюдается увеличение концентрации фибриногена на 20,2 % (р ≤ 0,05) по сравнению с животными без ЭГ, что свидетельствует о повышении свертываемости крови и риске образования тромбов в группе негативного контроля (табл. 2). У животных, получавших соединения РГПУ-189, РГПУ-147 и препарат сравнения сулодексид концентрация фибриногена в плазме крови была снижена на 18,5; 16,7; 19,1 % (р ≤ 0,05) соответственно по сравнению с группой животных с ЭГ (табл. 2). Изучение агрегационной активности тромбоцитов показало, что индуцированная АДФ скорость их агрегации у беременных самок с экспериментальным гестозом была выше на 41,4 % (р ≤ 0,05) по сравнению с таковыми без ЭГ. Все исследуемые вещества снижали скорость агрегации тромбоцитов: РГПУ-147 — на 14, 5 %, РГПУ-189 — на 41,7 % (р ≤ 0,05), сулодексид — на 42,8 % (р ≤ 0,05) (табл. 2). Таким образом, замена питьевой воды на 1,8 % р-р NaCl с первого дня гестации до родов вызывает развитие ЭГ, на что указывает наличие триады симптомов: гипертензия, протеинурия, отеки. Кроме того, в другой серии экспериментов нами были зафиксированы случаи неразвивающейся беременности, мертворожденного потомства, гибели самок с ЭГ в период гестации и после родов [11]. Выявлено, что ЭГ вызывает выраженные сдвиги в сторону гиперкоагуляции и гиперагрегации в плазменно-коагуляционном и сосудисто-тромбоцитарном звеньях гемостаза, о чем свидетельствует укорочение АЧТВ, протромбинового и тромбинового времени, повышение концентрации фибриногена и скорости агрегации тромбоцитов. Производные ГАМК — соединения РГПУ-147, РГПУ-189 и препарат сравнения сулодексид ограничивают проявления ЭГ на что указывает отсутствие изменений АД за период гестации, в меньшей степени выраженные протеинурия и отеки по сравнению с контрольной группой самок с ЭГ, снижение числа случаев мертворождения, неразвивающейся беременности, гибели самок во время беременности и в послеродовом периоде [3, 11]. Исследуемые соединения снижают повышенный коагуляционный и тромбогенный потенциал крови животных с ЭГ, что проявляется в увеличении АЧТВ, протромбинового и тромбинового времени, снижении концентрации фибриногена и уменьшении скорости агрегации тромбоцитов в группах животных, получавших вещества. В настоящее время одним из ключевых факторов, лежащих в основе патогенеза гестоза, является дисфункция эндотелия сосудов. В норме эндотелий обладает высокой антиагрегантной, антикоагуляционной и фибринолитической активностью, обусловленной синтезом дезагрегантов и антикоагулянтов (простациклина, оксида азота, антитромбина III и активаторов плазминогена). Очевидно, при ЭГ в результате нарушения функции эндотелия равновесие между его анти- и прокоагулянтными влияниями сдвигается в сторону последних, что приводит к возникновению и развитию изменений в системе гемостаза [1]. Нормализующее действие производных ГАМК на проявления гестоза связано, вероятно, с их эндотелиопротективной активностью, что показано в ряде работ и проявляется в улучшении эндотелий-зависимой вазодилатации, повышении стабильности и мощности функционирования системы синтеза NO, снижении сопротивления и увеличении эластичности сосудов при различных экспериментальных патологиях [4, 13]. В этих же исследованиях выявлено повышение под действием РГПУ-147 и РГПУ-189 АЧТВ, протромбинового и тромбинового времени, снижение концентрации фибриногена, что свидетельствует об их антикоагулянтной активности. Ранее получены доказательства наличия у производных ГАМК прямого и опосредованного антиагрегантного действия, связанного, вероятно, с изменением концентрации внутриклеточного Са 2+ в тромбоцитах посредством ингибирования кальмодулина [7] и с индукцией синтеза в эндотелиоцитах дезагрегантов [4, 5, 13]. Выводы При экспериментальном гестозе наблюдается повышение коагуляционного и тромбогенного потенциала крови, что проявляется в укорочении АЧТВ, протромбинового и тромбинового времени, увеличении концентрации фибриногена и скорости агрегации тромбоцитов, Производные ГАМК — соединения РГПУ-147 и РГПУ-189 в значительной степени предупреждают нарушения гемостаза у животных, получавших производные ГАМК и препарат сравнения сулодексид, о чем свидетельствует увеличение АЧТВ, протромбинового и тромбинового времени, снижение уровня фибриногена и уменьшение скорости агрегации тромбоцитов. По эффективности исследуемые соединения сопоставимы с препаратом сравнения сулодексидом.

Об авторах

Иван Николаевич Тюренков

ВолгГМУ

Email: fibfuv@mail.ru
д. м. н., проф, зав. каф. фармакологии и биофармации ФУВ

Людмила Борисовна Иванова

ВолгГМУ

Email: lusi_662_@list.ru
асс. кафедры фармакологии и биофармации ФУВ

Виктория Игоревна Карамышева

ВолгГМУ

Email: vikulenka86@mail.ru
соискатель кафедры фармакологии и биофармации ФУВ

Светлана Александровна Лебедева

ВолгГМУ

к. б. н., м. н. с. НИИ фармакологии

Список литературы

Дополнительные файлы