Immunocytochemistry in diagnostics of endometrial precancer

Full Text

Введение Пролиферативные процессы эндометрия проявляются рядом последовательных состояний, которые предшествуют эндометриальная интраэпителиальная неоплазия (ЭИН или последняя имеет собственный генез развития опухолевого процесса [1]. Доброкачественная эндометриальная гиперплазия (ЭГ) развивается на фоне пролиферативного эндометрия с нарушениями в результате более длительного дисбаланса эстрогенов и прогестерона. Плотность расположения желез эндометрия непостоянна во всем объеме. В некоторых участках железы по отношению к строме превышают соотношение 1 : 1. Появление фокусов эндометрия, в которых объем желез больше объема стромы, отличает доброкачественную эндометриальную гиперплазию от эндометрия с беспорядочной пролиферацией. Сложную гиперплазию от простой отличает наличие тесного расположения желез распространенного или очагового характера, с просветами часто неправильной формы, и имеющие сложное строение [4]. ЭИН является моноклональной неинвазивной генетически измененной неоплазией, которая развивается локально. В отличие от вышеописанных вариантов патологии эндометрия ЭИН рассматривается как предраковый процесс, который может приобретать злокачественный фенотип при дополнительных генетических повреждениях, трансформируясь в эндометриоидную аденокарциному (тип 1) [4, 8]. ЭИН характеризуется локальным изменением желез. Величина фокуса должна быть не менее 1 мм в диаметре. В пределах зоны неоплазии строма составляет менее 45 % от общей площади измененной ткани. Это первый ключевой диагностический признак ЭИН. Второй признак — атипия эпителия неопластических желез. Термин «атипия» при ЭИН предполагает любые цитологические отличия эпителия желез неопластического фокуса от эпителия желез «эндометриального типа», который может отражать любой вариант вышеописанных изменений. В настоящее время основным методом диагностики, а также верификации диагноза злокачественной опухоли и большинства доброкачественной патологии эндометрия остается рутинно выполняемое раздельное диагностическое выскабливание. Трудно недооценить степень риска и недостатки метода: травматичность, недостаточная абластика, необходимость госпитализации и анестезиологического пособия, вероятность ложно-отрицательного заключения именно при начальных формах рака эндометрия, отсутствие возможности иммуногистиохимического исследования. Слепое выполнение манипуляции не дает возможности определения локализации опухоли, глубины ее инвазии в миометрий, состояния придатков матки. Методы ранней диагностики: такие как цитологическое исследование аспирата, пайпель-биопсия эндометрия, используются недостаточно в связи с их низкой чувствительностью, а обзорная гистероскопия с прицельной биопсией — по причине высокой стоимости исследования, необходимости стационарных условий и анестезиологического пособия. Внедрение современных, высокотехнологичных методов обследования эндометрия (методики жидкостной цитологии с последующим иммуноцитохимическим исследованием) принципиально увеличивает возможности цитологической диагностики патологии эндометрия и приводит к более четкой постановке диагноза и сокращению периода обследования. Использование метода жидкостной цитологии обеспечивает стандартизацию забора материала, в 2 раза повышает чувствительность и специфичность цитологического исследования [6, 5, 7]. Чувствительность жидкостной цитологии достигает 95 %, а специфичность 66 % [2] именно при диагностике доброкачественной эндометриальной гиперплазии, эндометриальной интраэпителиальной неоплазии и рака эндометрия. Благодаря тому, что материал не сразу наносится на стекло, а вначале вносится в жидкую транспортную среду, из которой в дальнейшем при помощи цитоцентрифуги формируются клеточные мазки, повышается чувствительность и специфичность цитологического исследования, становится возможным выполнение иммуноцитохимического исследования (ИЦХИ). При ИЦХИ эндометрия определяется экспрессия рецепторов эстрогенов и прогестерона; белка р53, накопление которого в клетке обусловлено нарушением функции гена-супрессора опухолевого роста ТР53, ассоциированного с серозным вариантом РЭ (тип 2), (положительной считается реакция при цитоплазматической и мембранной окраске более 10 % опухолевых клеток); показателя пролиферативной активности опухолевых клеток Ki-67 (положительной считается реакция при цитоплазматической и мембранной окраске более 12–14 % опухолевых клеток); белка — опухолевого супрессора PTEN, который задерживает клеточное деление и облегчает апоптоз (негативная реакция); маркера плазматических клеток CD138 (показателя воспалительного процесса эндометрия). Использование иммуноцитохимического метода исследования эндометрия позволяет дифференцировать следующие нозологии: воспалительные процессы эндометрия, гиперплазию эндометрия (простую, сложную), атипическую гиперплазию эндометрия (простую, сложную), рак эндометрия [3, 7, 9, 10]. Сравнительная характеристика жидкостной цитологии и иммуноцитохимического исследования со стандартной цитологией эндометрия представлена в таблице 1. Как видно из таблицы 1 чувствительность и специфичность метода жидкостной цитологии превышают соответствующие критерии стандартного цитологического исследования. Кроме того, результаты жидкостной цитологии коррелируют с гистологическим исследованием в 99 %, по сравнению с 60 % при выполнении общепринятого цитологического анализа эндометрия. Цель исследования Изучить возможность использования метода жидкостной цитологии и последующего иммуноцитохимического исследования с целью диагностики предрака эндометрия. Материалы и методы В исследование было включено 94 женщины репродуктивного периода, возраст которых варьировал от 28 до 44 лет, медиана 34 ± 2 с ультразвуковыми признаками гиперплазии эндометрия (несоответствие величины эндометрия фазе менструального цикла, повышенная эхогенность, неоднородность и губчатость эхоструктуры эндометрия с множественными мелкими анэхогенными включениями и эффектом акустического усиления). Пациентки с ультразвуковой картиной полипов эндометрия и субмукозных миоматозных узлов исключались. Всем больным проводились следующие диагностические мероприятия: аспирация эндометрия на 21–22-й день менструального цикла, цитологическое исследование методом жидкостной цитологии, последующее иммуноцитохимическое исследование. Забор материала из полости матки осуществляли методом аспирации эндометрия шприцем-аспиратором в амбулаторных условиях, что не требовало расширения цервикального канала и обезболивания. Эндометрий помещался в адаптированную жидкую транспортную среду Thermo Shandon, материал обрабатывался на цитоцентрифуге Cytospin 4. Полученные монослойные цитопрепараты окрашивались гематоксилином и эозином. Оценивалась цитологическая картина, затем формировалось 6 цитопрепаратов, соответствующих числу используемых антител (рецепторы эстрогенов и прогестерона, PTEN, р53, Кi67, CD138). Для иммуноцитохимического исследования использовался CINtec Cytology Kit («MTM Laboratories», Германия). Мазки в виде центрифугата диаметром 7–8 мм высушивались на воздухе, фиксировались в этиловом 95 %-м спирте в течение 10 минут. Далее проводилась демаскировка антигенов в цитратном буфере рН 6,0, при температуре 95 °С в течение 10 минут с последующим остыванием в течение 20 минут. После чего смачивались в трис-буфере с твином (BioOptica) и обводились парафиновым карандашом. Первым этапом проводили подавление эндогенной пероксидазы при помощи 3 %-й перекиси водорода в течение 5 минут. Все последующие этапы исследования осуществлялись во влажной бане при температуре 28 °C. Первые антитела инкубировались в течение 30 минут. Список антител, использованных для иммуноцитохимического исследования эндометрия, представлен в таблице 2. Для визуализации реакции антиген-антитело применялась полимерная система детекции UltraVision компании LabVision, в качестве хромогена использовался диаминобензидин. После каждого из этапов до окрашивания диаминобензидином стекла со срезами промывались в трис-буфере с твином рН 7,1. Ядра окрашивали при помощи гематоксилина Майера, препараты заключались в среду BioMaunt. Значимость различий оценивалась с помощью критерия χ 2 Пирсона. Результаты исследования Результаты проведенной жидкостной цитологи и иммуноцитохимического исследования эндометрия пациенткам с ультразвуковыми признаками гиперплазии эндометрия с целью дифференциальной диагностики представлены в таблицах 3, 4. На основании выполненного цитологического исследования методом жидкостной цитологии наибольшую группу составили 54 женщины (57,4 ± 1,8 %), цитологическая картина эндометрия у которых соответствовала простой гиперплазии эндометрия без признаков атипии. Простая гиперплазия эндометрия с признаками клеточной атипии по цитологическим препаратам диагностирована 10 пациенткам, что составило — 10,6 ± 0,4 %. Признаки сложной гиперплазии эндометрия без атипии выявлены у 8 больных (8,6 ± 0,3 %). Цитологическая картина у 7 женщин (7,4 ± 0,3 %) соответствовала сложной гиперплазии эндометрия с клеточной атипией. У группы пациенток, составившей 15 человек (16,0 ± 0,8 %), на фоне соответствия цитологической картины эндометрия дню менструального цикла и отсутствия данных за простую или сложную гиперплазию эндометрия были выявлены плазматические клетки и лейкоцитарная инфильтрация, что характеризовало наличие хронических воспалительных изменений (табл. 3). В нашем исследовании не встретилось случая сочетания гиперплазии эндометрия и признаков хронического эндометрита, что, по данным литературы, может вызвать наибольшие затруднения дифференциальной диагностики данных процессов. Методика жидкостной цитологии с формированием необходимого числа монослойных клеточных препаратов по количеству используемых антител (1 цитологический препарат — 1 антитело) позволила провести последующее иммуноцитохимическое иследование с целью оценки экспрессии рецепторов стероидных гормонов (эстрогенов и прогестерона), опухолевого супрессора PTEN, маркеров пролиферации — р53 и Кi67, маркера плазматических клеток — CD138. Всем пациенткам, не зависимо от цитологического заключения проводился весь спектр иммуноцитохимического исследования. При проведении иммуноцитохимических реакций с антителами к рецепторам стероидных гормонов — экспрессия рецепторов эстрогенов и прогестерона составила при простой гиперплазии эндометрия без признаков клеточной атипии наибольшие значения среди всех видов гиперпластических процессов эндометрия: 83,1 ± 3,5 % и 64,0 ± 2,8 %. В группе женщин с цитологической картиной простой гиперплазии эндометрия с атипией экспрессия стероидных гормонов значительно снижалась до 54,0 ± 2,1 % и 33,2 ± 1,8 % — соответственно в 1,6 и 1,9 раза. Среди пациенток с диагностированной сложной гиперплазией эндометрия без атипии, экспрессия рецепторов эстрогенов и прогестерона составила 71,1 ± 2,8 % и 52,1 ± 2,3 %, а в случаях сложной гиперплазии эндометрия с атипией прослеживалось снижение уровня экспрессии гормонов более чем в 2 раза — до 32,2 ± 1,8 % и 20,1 ± 1,4 %. При выявленных признаках хронического воспалительного процесса (хронического эндометрита), уровень экспрессии рецепторов эстрогенов и прогестерона составил 86,0 ± 3,8 % и 91,0 ± 3,9 % и существенно не отличался от соответствующих показателей в неизмененном пролиферативном эндометрии. Выраженная экспрессия белка PTEN выявлена в группах женщин с цитологическими признаками простой и сложной гиперплазии эндометрия без атипии — соответственно 95,0 ± 4,7 % и 90,0 ± 4,5 %. Среди пациенток с хроническим воспалительным процессом — экспрессия PTEN приближалась к 100 % и составила — 97,0 ± 4,8 %. Уровень экспрессии PTEN у больных с атипической простой и атипической сложной гиперплазией эндометрия снижается в 1,2 раза по сравнению с группами пациенток, не имеющих атипические изменения, и достигает 78,0 ± 3,9 % и 74,0 ± 3,7 % (табл. 4). Экспрессия маркера пролиферации Ki67 в группе больных простой гиперплазией эндометрия без атипии составила 4,0 ± 0,3 %, а в случаях выявленной простой гиперплазии эндометрия с атипией возросла в 2,5 раза — до 10,2 ± 0,6 %. Подобная корреляция отмечена и в группе пациенток со сложной гиперплазией без атипии, в которой уровень экспрессии Ki67 не превышал 6,1 ± 0,4 %, а в случаях сложной гиперплазии с атипией — возрастал почти в 2 раза — до показателя 11,0 ± 0,7 %. Экспрессия маркера p53 выявлена только у женщин с атипической простой и сложной гиперплазией эндометрия и составила — 7,1 ± 0,2 % и 9,0 ± 0,4 % соответственно. В группе больных, включавшей 15 женщин, цитологическая картина эндометрия у которых свидетельствовала о признаках хронического воспаления реакция на CD138 была положительной в 94,3 ± 1,3 % (табл. 4). Полученные результаты иммуноцитохимического исследования различных групп пациенток с УЗ признаками гиперплазии эндометрия и использованные нами маркеры можно рассматривать в качестве дифференциально-диагностических критериев патологических состояний эндометрия, а также использовать их с целью формирования иммуноцитохимического профиля гиперпластических состояний эндометрия. Так, простая гиперплазия эндометрия без атипии иммуноцитохимически характеризуется высокой экспрессией рецепторов стероидных гормонов — эстрогенов и прогестерона, высоким уровнем PTEN и низким показателем Ki67. В случаях простой гиперплазии эндометрия с атипией снижается уровень экспресии рецепторов эстрогенов и прогестерона, PTEN, повышается уровень Ki67, а также определяется экспрессия р53. Для сложной гиперплазии эндометрия с атипией иммуноцитохимический профиль характеризуется низким уровнем экспресии рецепторов эстрогенов и прогестерона, PTEN, высокая экспрессия Ki67 и р53. Выводы Анализ результатов выполненного исследования показал следующее: 1. Метод жидкостной цитологии эндометрия информативен с целью дифференциальной диагностики патологических процессов эндометрия. 2. Иммуноцитохимическое исследование эндометрия расширяет возможности проведения дифференциальной диагностики патологических состояний эндометрия. 3. Уровень экспрессии гена супрессора опухолевого роста PTEN, экспрессия рецепторов эстрогенов и прогестерона снижается в ряду: простая гиперплазия без атипии, сложная гиперплазия без атипии, простая гиперплазия с атипией, сложная гиперплазия с атипией. 4. Усиление экспрессии маркеров пролиферации р53 и Кi67 отмечается только при атипической простой и сложной гиперплазии эндометрия. 5. Положительная реакция на CD138 характеризует воспалительный процесс эндометрия. 6. Иммуноцитохимическое исследование эндометрия открывает возможность проведения патогенетического лечения женщин с гиперпластическими процессами эндометрия.

About the authors

Tatyana Ivanovna Dzyubiy

City Policlinic N 109, St. Petersburg

doctor

Anna Eduardovna Protasova

I. I. Mechnikov North-Western State Medical University, Ministry of Public Health of Russian Federation

Email: rectorat@spbmapo.ru
professor

Grigoriy Aleksandrovich Raskin

L. G. Sokolov Clinical Hospital N 122

Email: infomed@med122.com

Anna Alekseyevna Tsypurdeyeva

D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS

Email: Tsypurdeeva@mail.ru
assistant professor of Operative Gynecology Department

Natalya Igorevna Tapilskaya

State Pediatric Medical University

M.D., professor. Department of obstetrics and gynecology, department of oncology

References

Supplementary files