Особенности полиморфизма генов NAT2 и CYP1В1 у пациентов с наружным генитальным эндометриозом в зависимости от переносимости мелатонина

Полный текст

ОБОСНОВАНИЕ

Наружный генитальный эндометриоз (НГЭ) представляет собой одну из наиболее актуальных проблем современной гинекологии. Это обусловлено как высокой частотой встречаемости заболевания, так и многообразием его клинических проявлений: болевым синдромом, бесплодием, невынашиванием беременности, рецидивирующим характером заболевания. Эндометриоз выявляют у 70 % пациенток, обращающихся к врачу с жалобами на болевой синдром, и у 35–50 % пациенток, страдающих бесплодием [1, 2]. На сегодняшний день нет универсального метода, который бы гарантировал полное излечение и отсутствие рецидивов НГЭ. Несмотря на существующие методы комбинированного лечения, эндометриоз характеризуется высокой частотой рецидивов, что приводит к повторным хирургическим вмешательствам. Наряду с хирургическим удалением очагов, патогенетически обоснованная гормональная терапия занимает ведущее место в лечении заболевания [3]. Однако следует отметить недостатки схем гормономодулирующей терапии: невозможность наступления беременности на фоне лечения большинством препаратов, оказывающих антигонадотропное действие, наличие серьезных побочных эффектов, а также неэффективность стандартных схем лечения у части больных. В связи с этим дальнейшее изучение патогенеза заболевания, поиск новых препаратов с терапевтическим эффектом в отношении эндометриоза или описание таких эффектов у лекарственных средств является важной и актуальной задачей в современной гинекологии.

Одним из перспективных препаратов с потенциально лечебным эффектом в отношении генитального эндометриоза является мелатонин. Мелатонин — гормон индоламинового типа, синтезируемый секреторными клетками эпифиза из серотонина под действием N-ацетилтрансферазы (NAT) и оксиндол-О-метилтрансферазы [4]. Рецепторы к мелатонину присутствуют во многих органах репродуктивной системы, таких как молочная железа, миометрий, клетки гранулезы и т. д. [5]. Мелатонин — мощный антиоксидант [6, 7], он также оказывает противоопухолевое, онкостатическое действие. Экзогенное введение данного препарата приводит к снижению частоты возникновения опухолей, тогда как пинеалэктомия стимулирует рост опухолей [2, 8].

Известно, что развитие эндометриоза сопровождается неэффективной воспалительной реакцией, оксидативным стрессом, избыточной пролиферацией, неоангиогенезом, изменением выработки и рецепции стероидных гормонов. Терапевтический эффект мелатонина при эндометриозе может быть реализован путем нейтрализации свободных радикалов, оказывающих повреждающее действие [6], а также путем подавления синтеза провоспалительных цитокинов, изменения продукции матриксных металлопротеиназ и моделирования процессов ангиогенеза [9, 10]. Известно, что мелатонин снижает активность ароматазы, повышает экспрессию эстроген-сульфотрансферазы, что позволяет говорить об антиэстрогенном влиянии гормона эпифиза [2]. T.J. Ness описали терапевтический эффект приема мелатонина в дозе 10 мг в день в течение 8 нед. для лечения эндометриоз-ассоциированной боли [11].

На основании изучения модели хирургически индуцированного эндометриоза у крыс линии Wistar были продемонстрированы высокая эффективность применения мелатонина, а также положительный дозозависимый эффект в отношении резорбции и уменьшения эндометриоидных гетеротопий [12]. В клинической практике у больных НГЭ наблюдался более выраженный положительный эффект мелатонина в составе комбинированной терапии в отношении уменьшения болевого синдрома и улучшения психоэмоционального фона по сравнению со стандартной гормономодулирующей терапией [13].

Полученные данные позволяют рассматривать мелатонин как перспективный и эффективный препарат при лечении эндометриоза. Антигонадотропный эффект мелатонина дозозависимый, но при применении препарата у части пациентов возникает ряд побочных эффектов, таких как головная боль, нарушения сна в виде частых просыпаний по ночам, бессонницы, тошнота, выраженная утренняя сонливость, которые являются причиной прекращения курса терапии.

Можно предположить, что плохая переносимость препарата связана с полиморфизмом генов, кодирующих ферменты, вовлеченные в метаболизм мелатонина.

Цель — провести сравнительный анализ полиморфизма некоторых генов, кодирующих ферменты, вовлеченные в метаболизм мелатонина.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

При выполнении работы образцы ДНК получены от 59 пациенток репродуктивного возраста с верифицированным НГЭ, который был установлен на основании операционной лапароскопии и подтвержден результатами гистологического исследования. Стадию распространенности процесса определяли согласно пересмотренной классификации Американского общества фертильности (R-AFS). Все пациентки получали терапию мелаксеном в дозе 6 мг от 2 до 6 мес.

Экстракцию геномной ДНК из лимфоцитов периферической крови проводили в соответствии с методикой, приведенной в руководстве J. Sambrook и соавт. с некоторыми модификациями [14].

Полиморфные варианты генов NAT2, CYP1В1 определяли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) со специфическими олигопраймерами с последующим рестрикционным анализом. Для амплификации использовали программируемый термоциклер фирмы «ДНК-технология» (Москва). Смесь для амплификации объемом 25 мкл включала 15 нМ каждого праймера, 67 мМ трис-HCl (рН 8,8), 16,6 мМ сульфата аммония, 6,7 мМ MgCl₂, 6,7 мкМ ЭДТА, 10 мМ меркаптоэтанола, 170 мкг BSA, 1,0 мМ каждого dNTP и 1U ДНК-полимеразы («Бион», Москва). Для амплификации фрагмента гена CYP1A1 применяли праймеры: CYP1B1 F CGTGGGGAGGGACCGTCTGC, CYP1B1 R TCTCCGGGTTAGGCCACTGC. Для амплификации фрагмента гена NAT2 использовали праймеры: NAT2 F 5’<GCT GGG TCT GGA AGC TCC TC>3’; NAT2 R 5’<TTG GGT GAT ACA TAC ACA AGG G>3’.

Условия проведения ПЦР представлены в табл. 1.

 

Таблица 1. Условия проведения полимеразной цепной реакции

Ген	Денатурация	Денатурация	Отжиг	Синтез	Синтез
	32 цикла
NAT2	94 °С — 7 мин	94 °С — 1 мин 10с	52 °С — 1 мин 15 c	68 °С — 1 мин 30 c	72 °С — 7 мин
CYP1B1	95 °С — 4 мин	95 °С — 40 c	60 °С — 40 c	72 °С — 40 с	72 °С — 5 мин

 

Рестрикцию амплифицированных ДНК-фрагментов проводили согласно рекомендации фирмы-изготовителя («Сибэнзим»).

ПЦР-продукты гидролизировали эндонуклеазой рестрикции (см. табл. 1) при 37 °С в течение 16 ч в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 5 мкл амплификата, 3 мкл воды, 1 мкл ×10 буфера, рекомендованного производителем для каждой рестриктазы, и 10 ед. (0,5 мкл) рестриктазы.

Рестриктазы и анализ полиморфных вариантов генов метаболизма представлены в табл. 2.

 

Таблица 2. Рестриктазы и анализ полиморфных вариантов генов метаболизма

Ген	Полиморфизм	Размер ПЦР-продукта	Эндонуклеаза	Аллель и размер фрагментов рестрикции
CYP1B1	L432V	227 п. о.	Pst I	I — 208 + 19 п. о. V — 227 п. о.
NAT2	C481T	547 п. о.	Kpn1	S1 — 547 п. о.
	G590A	547 п. о.	Taq1	S2 — 392 + 15 п. о.
	G857A	547 п. о.	BamH1	S3 — 547 п. о.

Примечание: п. о. — пары оснований; ПРЦ — полимеразная цепная реакция.

 

Полноту гидролиза оценивали по результатам электрофореза в 7,5 % полиакриламидном геле (ПААГ).

ПААГ окрашивали водным раствором бромистого этидия (0,5 мкг/мл), просматривали в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе Macrovue 50 (Pharmacia LKB, Великобритания) и регистрировали изображение с применением системы видео-гель-документации (Vilber Lourmat).

Статистическую обработку полученных результатов выполняли в программе Microsoft Excel 2002. Достоверность различий частот определяли с помощью точного двустороннего критерия Фишера по стандартной формуле с учетом поправки Йейтса для парных сравнений с контрольной группой и с помощью критерия хи-квадрат (÷²) по стандартной формуле с учетом поправки Йейтса для парных сравнений и поправки Бонферрони для множественных сравнений с контрольной группой.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Исследовали полиморфизм генов ариламин-N-ацетилтрансферазы 2 (NAT2) и цитохрома P450 1B1 (CYP1B1). Образцы ДНК были получены из лимфоцитов периферической крови 59 пациенток с НГЭ I–IV стадий по классификации R-AFS, подтвержденным лапароскопически и гистологически, которые получали терапию мелатонином в дозе 6 мг от 2 до 6 мес. Хорошо переносили мелатонин 64 % (n = 38) пациенток, у 36 % (n = 21) женщин отмечены плохая переносимость препарата и побочные эффекты (сонливость, частые просыпания по ночам, головные боли, бессонница), в связи с которыми препарат пришлось отменить.

Известно, что NAT2 — ген, продукт которого играет важную роль в ацетилировании ароматических и гетероциклических аминов, лекарственных препаратов, содержащих ароматические аминные группы, а также участвует в метаболизме мелатонина.

Гомозиготное состояние по N-аллелю гена NAT2 в группе пациенток с НГЭ отмечено в 6,78 % случаев (табл. 3).

 

Таблица 3. Распределение частот генотипов и аллелей гена NAT2 у больных наружным генитальным эндометриозом

Генотипы/аллели	Наружный генитальный эндометриоз
	n	%
N/N	4	6,78
S1/N	17	28,8
S2/N	3	5,1
S3/N	1	1,7
S1/S1	12	20,3
S1/S2	11	18,64
S1/S3	–	–
S2/S2	7	11,86
S2/S3	4	6,77
Всего	59	100
Аллели
N	29	24,58
S1	52	44,1
S2	32	27,1
S3	5	4,2

 

Доля больных с НГЭ, гомо- и гетерозиготных (генотипы S1/N, S2/N, S3/N) по N-аллелю, относящихся к категории «быстрых» ацетиляторов, равнялась 42,37 %. Частота аллеля дикого типа (N) в группе больных НГЭ составила 24,58 %.

 

Таблица 4. Распределение частот генотипов и аллелей гена NAT2 в зависимости от переносимости мелатонина

Генотипы/аллели	Хорошая переносимость		Плохая переносимость		р
	n	%	n	%
N/N	1	2,6	3	14,3	>0,05
S1/N	9	23,7	8	38,1	>0,05
S2/N	1	2,6	2	9,5	>0,05
S3/N	1	2,6	–	–	>0,05
S1/S1	9	23,7	3	14,3	>0,05
S1/S2	10	26,3	1	4,76	>0,05
S1/S3	–	–	–	–	–
S2/S2	5	13,2	2	9,5	>0,05
S2/S3	2	5,3	2	9,5	>0,05
Всего	38	100	21	100
Аллели
N	13	17,1	16	38,1	0,02
S1	37	48,7	15	35,7	>0,05
S2	23	30,3	9	21,8	>0,05
S3	3	3,9	2	4,76	>0,05

 

У пациенток с плохой переносимостью мелатонина частота аллеля дикого типа (N) была достоверно выше (38,1 %), чем у пациенток с хорошей переносимостью препарата (17,1 %) (табл. 4). Гомо- и гетерозиготы по N-аллелю (фенотип быстрого ацетилирования; генотипы N/N, S1/N, S2/N, S3/N) достоверно чаще встречались в группе пациенток с плохой переносимостью препарата по сравнению с женщинами, у которых не было побочных эффектов и переносимость мелаксена была хорошая (61,9 и 31,6 % соответственно, p = 0,024) (рис. 1). Согласно коэффициенту отношения шансов (ОШ) носительство аллеля дикого типа (N) в 3,5 раза увеличивает риск плохой переносимости мелатонина (ОШ 3,521, ДИ 1,154–10,742).

 

Рис. 1. Распределение частот генотипов NAT2 в зависимости от переносимости мелатонина

 

Цитохром P450 1B1 (CYP1B1) является членом семейства генов цитохрома P450 и кодирует один из основных ферментов, участвующих в гидроксилировании эстрогенов и антиоксидантной защите (фермент первой фазы детоксикации). Данный фермент вовлечен в процесс деградации мелатонина. Существует несколько полиморфных вариантов гена CYP1B1, одним из которых является полиморфизм 4326 C/G (L432V, rs1056836), связанный с более высокой каталитической активностью по сравнению с аллелем дикого типа.

При анализе распределения частот генотипов и аллелей гена CYP1B1 не было выявлено достоверных отличий в подгруппах с различной переносимостью мелатонина. Полиморфный аллель G, связанный с повышенной каталитической активностью, при плохой переносимости препарата встречался несколько чаще, чем при хорошей (47,6 и 38,2 % соответственно) (табл. 5).

 

Таблица 5. Распределение частот генотипов и аллелей гена CYP1B1 у больных наружным генитальным эндометриозом в зависимости от переносимости мелатонина

Генотипы/аллели	Хорошая переносимость		Плохая переносимость
	%	n	%	n
С/С	42,1	16	28,6	6
С/G	39,4	15	47,6	10
G/G	18,4	7	23,8	5
Всего	100	38	100	21
Аллели
G	38,2	29	47,6	20
C	61,8	47	52,4	22
Всего	100	76	100	42

 

Проанализированы частоты некоторых сочетанных генотипов NAT2 и CYP1B1, характерные для различного уровня накопления мелатонина в организме. Для максимального накопления мелатонина наиболее характерны генотип, соответствующий фенотипу «быстрого» ацетилирования по NAT2 (накопление эндогенного мелатонина), и низкая каталитическая активность CYP1B1 (замедление деградации как эндогенного, так и экзогенного мелатонина), а для минимального — генотип, соответствующий фенотипу «медленного» ацетилирования по NAT2 (накопление эндогенного мелатонина), и высокая каталитическая активность CYP1B1 (замедление деградации как эндогенного, так и экзогенного мелатонина). Установлено достоверное повышение частоты встречаемости генотипа N/N(NAT2)+C/C(CYP1B1), соответствующего фенотипу быстрого накопления мелатонина у пациентов с плохой переносимостью препарата (14 и 0 % соответственно, p = 0,04) (рис. 2).

 

Рис. 2. Частоты сочетанных генотипов по генам NAT2 и СYР1В1 у пациентов с различной переносимостью мелатонина

 

Согласно коэффициенту ОШ носительство сочетанного генотипа N/N(NAT2)+C/C(CYP1B1) в 14 раза увеличивает риск плохой переносимости мелатонина (ОШ 14,568, ДИ 1,002–100,742).

Таким образом, при исследовании полиморфизма генов NAT2 выявлено, что аллель дикого типа (N) гена NAT2 у больных НГЭ ассоциирован с плохой переносимостью мелатонина. При анализе частот сочетанных генотипов NAT2 и CYP1B1 было также установлено, что фенотип «быстрого» ацетилирования по NAT2(N/N) в сочетании с низкой каталитической активностью CYP1B1(C/C) встречался чаще у пациенток с плохой переносимостью мелатонина по сравнению с пациентками, хорошо переносившими терапию. Можно предположить, что плохая переносимость препарата у индивидуумов с сочетанным генотипом N/N(NAT2)+C/C(CYP1B1) обусловлена достаточным уровнем синтеза эндогенного мелатонина и недостаточно быстрой инактивацией как эндогенного, так и экзогенного мелатонина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Применение мелатонина у больных НГЭ с болевым синдромом, страдающих бесплодием, можно рассматривать в качестве эффективного компонента как в комбинированной терапии заболевания, так и в качестве монотерапии. Однако применение мелатонина в клинической практике у ряда женщин в качестве комбинированной терапии НГЭ не всегда представляется возможным в связи с рядом причин, основными из которых являлись плохая переносимость препарата и наличие побочных эффектов.

На основании полученных результатов исследования установлено, что у больных НГЭ аллель дикого типа (N) гена NAT2 ассоциирован с плохой переносимостью мелатонина. Отмечено также, что фенотип «быстрого» ацетилирования по NAT2(N/N) в сочетании с низкой каталитической активностью CYP1B1(C/C) встречался чаще у пациенток с эндометриозом, плохо переносящих мелатонин, по сравнению с группой пациенток, которые хорошо переносили терапию.

Полученные результаты обосновывают необходимость продолжения исследований в данном направлении для углубленного понимания патогенеза заболевания, а также применения мелатонина в качестве таргетной терапии. Однако у больных НГЭ с аллелем дикого типа (N) гена NAT2 назначение мелатонина мы считаем нецелесообразным в связи с развитием многочисленных побочных эффектов.

ДОПОЛНИТЕЛЬНО

Источник финансирования. Исследование выполнено при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации в рамках темы фундаментальных научных исследований 2019–2021 гг.: АААА-А19-119030490009-6.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Об авторах

Татьяна Эдуардовна Иващенко

Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта

Email: tivashchenko2011@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8549-6505
Scopus Author ID: 7004724202

доктор биологических наук, профессор, отдел молекулярной медицины

Россия, 199034, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д.3

Мария Игоревна Ярмолинская

Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта; Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова

Email: m.yarmolinskaya@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-6551-4147
SPIN-код: 3686-3605
Scopus Author ID: 7801562649
ResearcherId: P-2183-2014

профессор РАН, доктор медицинских наук, профессор, руководитель отдела гинекологии и  эндокринологии, руководитель Центра

Россия, 199034, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д.3; 191015, Санкт-Петербург, ул. Кирочная, 41

Саимат Шауаловна Тхазаплижева

Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта

Автор, ответственный за переписку.
Email: saim86@yandex.ru

аспирант отдела гинекологии и эндокринологии

Россия, 199034, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д.3

Список литературы

Дополнительные файлы