Ovarian aromatase activity: evaluation methods and the clinical significance in IVF protocols

Pavel P. Yakovlev; Яковлев Павел Павлович; Julia S. Krylova; Крылова Юлия Сергеевна; Irina D. Mekina; Мекина Ирина Дмитриевна; Victoria O. Polyakova; Полякова Виктория Олеговна; Igor M. Kvetnoy; Кветной Игорь Моисеевич; Marina A. Tarasova; Тарасова Марина Анатольевна; Igor Yu. Kogan; Коган Игорь Юрьевич; Alexander M. Gzgzyan; Гзгзян Александр Мкртичевич; Valeriia R. Rodichkina; Родичкина Валерия Руслановна

doi:10.17816/JOWD67261-69

Ovarian aromatase activity: evaluation methods and the clinical significance in IVF protocols

Authors: Yakovlev P.P.¹, Krylova J.S.¹, Mekina I.D.¹, Polyakova V.O.¹, Kvetnoy I.M.¹, Tarasova M.A.¹, Kogan I.Y.¹, Gzgzyan A.M.¹, Rodichkina V.R.¹
Affiliations:
1. Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott
Issue: Vol 67, No 2 (2018)
Pages: 61-69
Section: Articles
URL: https://journals.eco-vector.com/jowd/article/view/8870
DOI: https://doi.org/10.17816/JOWD67261-69
ID: 8870

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Introduction. Cytochrome P450 aromatase is a key enzyme in the biosynthesis of estrogens from androgens. Some gynecological diseases are accompanied with changes in the activity of ovarian aromatase. Moreover, changes in the acti vity of ovarian aromatase are associated with the response to standard gonadotrophin stimulation in women undergoing in vitro fertilization. A new effective method determining the activity of ovarian aromatase without using ovarian tissue biopsy has been developed.

The purpose of the present study was to compare the detection of ovarian aromatase activity using the ratio of estradiol to AMH on the second day of the menstrual cycle through the immunocytochemical evaluation of aromatase expression in cumulus cells.

Methods. Depending on the activity of the ovarian aromatase, calculated on the second day of the menstrual cycle, 16 patients undergoing IVF protocols were categorized into three groups: eight patients with low activity, four with normal activity, and four with high activity. The patients did not differ in age and BMI. The expression of aromatase in cumulus cells obtained through transvaginal puncture was investigated by the immunocytochemical method.

Results. The fluorescence intensities in the low, normal, and high activity groups were 134 (122–161), 238 (201–251), and 259 (240–299), respectively. Differences between these groups were statistically significant (p = 0.008). There was a pronounced positive correlation between the activity of ovarian aromatase, calculated on day two of the menstrual cycle, and the intensity of aromatase fluorescence in cumulus cells (Spearman, r = 0.75, p = 0.001, n = 16).

Keywords

ovarian aromatase, in vitro fertilization, cumulus cell, infertility

Full Text

Введение

Ароматаза Р450 является ключевым ферментом синтеза эстрадиола (Э2) в антральных фолликулах яичника. Она играет важную роль в определении динамики фолликулогенеза и качества получаемых ооцитов при стимуляции суперовуляции яичников гонадотропинами в протоколах ЭКО. Активность ароматазы зависит от множества факторов как внегонадного, так и внутрияичникового происхождения [1]. Достаточный уровень Э2 необходим для правильного развития ооцитов, поскольку незрелые ооциты человека имеют Э2-зависимые механизмы цитоплазматического созревания [2, 3]. Ароматазная активность клеток гранулезы, полученных в протоколе экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) у забеременевших пациенток, по мнению ряда авторов, значительно выше, чем у незабеременевших, после переноса одинакового числа эмбрионов [4]. Ооциты, полученные из фолликулов с более высоким уровнем Э2 в фолликулярной жидкости, имели большую частоту оплодотворения [5–7]. Также большее соотношение Э2 к тестостерону, более высокий уровень Э2 в фолликулярной жидкости и больший объем фолликулов в момент пункции ассоциирован с наступлением беременности у пациенток, проходящих протоколы ЭКО [7–9]. В то же время низкое содержание интрафолликулярного Э2 у пациентов, например, с дефицитом 17α-гидроксилазы в протоколе ЭКО сопровождается задержкой эмбрионального развития in vitro и, как следствие, ассоциировано с худшими исходами [10].

По данным литературы, имеется связь между изменением ароматазной активности с полиморфизмом гена CYP19A1 [11–13] и исходом контролируемой овариальной стимуляции у женщин в протоколах ЭКО [14, 15]. Кроме того, ряд гинекологических заболеваний сопровождается изменением активности овариальной ароматазы [1].

В настоящее время разработаны методики определения активности овариальной ароматазы, позволяющие достаточно эффективно определять ее активность, не прибегая к био псии яичника [16]. К одной из них относится определение коэффициента активности ароматазы овариальных фолликулов по соотношению Э2 и антимюллерова гормона (АМГ), отражающего число антральных фолликулов, на 2-й день менструального цикла (д. м. ц.) [17].

В данной работе мы сопоставили коэффициент активности ароматазы овариальных фолликулов, определенный на 2-й д. м. ц., с результатами оценки экспрессии ароматазы P450 в кумулюсных клетках фолликулов пациенток, полученных при проведении протоколов ЭКО.

Материалы и методы исследования

В исследование было включено 16 пациенток, отвечающих следующим критериям: возраст — 20–35 лет, наличие бесплодия, требующего применения ЭКО (ЭКО/ИКСИ), АМГ — более 1,0 нг/мл. Критериями исключения явились: ИМТ — менее 18 кг/м2 и более 35 кг/м2, наружный генитальный эндометриоз III/IV ст., сахарный диабет 1-го типа, наличие противопоказаний для проведения ЭКО согласно приказу МЗ от 30.08.2012 № 107н (ред. от 11.06.2015).

Перед вступлением в протокол (на 2-й д. м. ц.) у всех пациенток в сыворотке крови определяли содержание ФСГ, ЛГ, ТТГ, пролактина, Э2 и АМГ с последующим вычислением ароматазной активности яичников по формуле КА = Э2/АМГ, где КА — коэффициент активности ароматазы овариальных фолликулов; Э2 — базальный уровень эстрадиола в крови на 2-й д. м. ц. в пмоль/л; АМГ — уровень антимюллерова гормона в крови на 2-й д. м. ц. в нг/мл. При КА меньше 37,8 овариальная ароматазная активность оценивалась как низкая; при КА от 37,8 до 90,7 — нормальная; при КА больше 90,7 — высокая [17].

В зависимости от ароматазной активности фолликулов пациентки были разделены на три группы: I группа с низкой (n = 8, 50 %), II группа с нормальной (n = 4, 25 %) и III группа с высокой активностью овариальной ароматазы (n = 4, 25 %). Группы были сопоставимы по возрасту, длительности бесплодия, индексу массы тела.

С целью стимуляции суперовуляции использовали протокол с антагонистами ГнРГ. Введение рекомбинантного ФСГ проводили ежедневно со 2–3-го д. м. ц. Введение гонадотропинов начинали при возникновении усло вий для начала стимуляции суперовуляции по данным ультразвукового исследования: отсутствие кист яичников, толщина эндометрия не более 5 мм. В процессе контролируемой стимуляции суперовуляции выполняли ультразвуковой мониторинг роста фолликулов и эндо метрия. На 5-й день стимуляции овуляции корректировали дозу гонадотропинов и решали вопрос о назначении антагонистов ГнРГ для предотвращения преждевременного пика ЛГ при достижении одним или несколькими лидирующими фолликулами среднего размера 14 мм. Критерием назначения триггера финального созревания ооцитов являлось достижение тремя лидирующими фолликулами среднего размера не менее 17 мм. В качестве триггера овуляции использовали препарат хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) в дозе 10 000 МЕ (прегнил, Organon, Нидерланды). Через 36 часов после введения триггера овуляции проводили трансвагинальную пункцию фолликулов и аспирацию ооцитов под давлением 140 мм рт. ст. с исполь зованием однопросветной иглы диаметром 17G (Cook Medical, Bloomington, IN, USA).

Определение экспрессии овариальной ароматазы в кумулюсных клетках иммуноцитохимическим методом

Полученные ооцит-кумулюсные комплексы промывали 3–4 раза в среде Flushing Medium (Origio, Дания). После чего часть кумулюсных клеток отделяли от ооцит-кумулюсного комплекса, промывали в фосфатном буфере и помещали на стекла с полилизиновым покрытием, высушивали и фиксировали 4 % раствором параформальдегида. Для промывки применяли фосфатно-солевой буфер с Tween х20. Клетки инкубировали в течение 30 минут с блокирующей сывороткой при комнатной температуре. После промывки наносили первичные антитела к Aromatase (Abcam (ab18995) разведение 1 : 400), инкубировали 1 час при комнатной температуре. В качестве вторичных антител использовали Alexa fluor 647®, Abcam. После отмывки срезы докрашивали DAPI, appliChem. Положительная реакция с ароматазой имела красную флуоресценцию, ядра — синюю (рис. 1). Все образцы были заключены в монтирующую среду DACO. Образцы исследовали на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе Olympus FV1000D. Для изучения объектов определяли интенсивность флюоресценции в условных единицах. Оценку и подсчет прово дили в 10 полях зрения при увеличении ×400.

Статистическую обработку результатов выполняли с использованием пакета прикладных программ STATISTICA v 10.0 for Windows (Statsoft Inc., США). Методами описательной статистики для количественных признаков с распределением, отличающимся от нормального, рассчитывали медиану, 25-й и 75-й процентили. Для сравнительного анализа данных, полученных в двух группах, использовали критерий U Манна – Уитни, в нескольких группах — критерий ANOVA по Краскелу – Уоллису. Корреляционный анализ осуществляли при помощи коэффициента корреляции Спирмана. Различия между группами считались достоверными при р < 0,05.

Результаты исследования

При сравнении клинико-анамнестических характеристик обследованных женщин пациентки были сопоставимы по возрасту, индексу массы тела, структуре и длительности течения бесплодия. У пациенток с низкой актив ностью овариальной ароматазы основной причиной бесплодия являлся синдром поликистозных яичников (СПЯ). В группе с нормальной и высокой активностью ароматазы определяющими причинами бесплодия были мужской и трубно-перитонеальный факторы (табл. 1).

Таблица 1 / Table 1. Характеристика исследуемых групп

Basic characteristics of the patients

Параметр	Ароматазная активность яичников			р
Параметр	низкая (n = 8)	нормальная (n = 4)	высокая (n = 4)	р
Трубно-перитонеальный фактор	1	1	1	–
Синдром поликистозных яичников	5	–	–	–
Мужской фактор бесплодия	2	3	3	–
Индекс массы тела	22 (20–25,5)	22 (19,5–24,5)	21 (19,5–24,5)	0,91
Возраст (годы)	32,25 (28,5–35)	31 (29,5–32,5)	33,2 (30,5–36)	0,56

Уровень АМГ в группе с низкой ароматазной активностью был наибольшим среди обсле дуемых групп, тогда как в группе с высокой активностью овариальной ароматазы был наименьшим. Базальный уровень ФСГ и ЛГ, так же как и уровни пролактина и ТТГ в крови, достоверно не отличались в обследованных группах (табл. 2).

Таблица 2 / Table 2. Результаты гормонального исследования женщин

Hormonal levels in the study groups

Параметр	Ароматазная активность яичников			р
Параметр	низкая (n = 8)	нормальная (n = 4)	высокая (n = 4)	р
АМГ, нг/мл	7,1 (5,6; 9,4)	5,0 (3,5;5,7)	1,5 (1,2; 2,6)	–
Эстрадиол, пмоль/л	161,5 (137,5; 176,0)	208,5 (167,0; 304,5)	288,5 (173,5; 450,0)	–
ФСГ, МЕ/л	5,3 (4,4; 7,4)	5,8 (5,5; 6,6)	7,2 (2,2; 8,0)	0,35
Пролактин, мМЕ/л	332,0 (142,0; 363,0)	307,5 (268,0; 367,0)	255,5 (194,0; 317,0)	0,53
ЛГ, МЕ/л	5,5 (5,0; 6,1)	5,0 (4,3; 7,8)	5,0 (4,4; 5,2)	0,72
ТТГ, мМЕ/л	1,3 (1,2; 2,4)	1,8 (1,0; 4,0)	2,0 (2,0; 2,0)	0,48

При иммуноцитохимической оценке экспрес сии ароматазы в кумулюсных клетках интен сивность флюоресценции в группе с низ кой активностью овариальной ароматазы (n = 8) составила 134 (122–161) (рис. 1, c), в группе с нормальной активностью (n = 4) — 238 (201–251) (рис. 1, b), в группе с высокой активностью (n = 4) — 259 (240–299) (рис. 1, a). Различия между данными группами были статистически значимыми (p = 0,008). При попарном сравнении экспрессия ароматазы Р450 в кумулюсных клетках в группе с низкой активностью была достоверно меньше, чем в группе с нормальной и высокой активностью (табл. 3).

Таблица 3 / Table 3. Интенсивность экспрессии ароматазы в клетках кумулюса в исследуемых группах

Aromatase expression in cumulus cells of the study groups

Параметр

Ароматазная активность яичников

Kruskal – Wallis ANOVA

Mann – Whitney U Test

низкая (n = 8)

нормальная (n = 4)

высокая (n = 4)

Интенсивность флюоресценции

134,5 (122; 161)

238 (201; 251)

259 (240; 299)

p = 0,0087

pI–II = 0,021

pII–III = 0,19

pI–III = 0,008

Рис. 1. Иммуноцитохимия, × 400, экспрессия ароматазы в кумулюсных клетках (красная флюоресценция): a — высокая интенсивность; b — нормальная; c — низкая

В результате корреляционного анализа коэффициента активности ароматазы овариальных фолликулов с иммуноцитохимической оценкой экспрессии ароматазы в гранулезных клетках была выявлена высокая положительная корреляционная взаимосвязь (Spearman, r = 0,75, p = 0,001, n = 16) (рис. 2).

Рис. 2. Зависимость между коэффициентом активности овариальной ароматазы и экспрессией ароматазы Р450 в клетках кумулюса

Клинические результаты циклов ЭКО. В группе с низкой активностью овариальной ароматазы перенос эмбрионов (ПЭ) проведен у четырех пациенток. Клиническая беременность была зафиксирована у двух пациенток. У трех пациенток ПЭ был отменен в связи с высоким риском синдрома гиперстимуляции яичников (СГЯ) средней и тяжелой степеней, у одной по причине проведения предымплантационного генетического тестирования (ПГТ). В группе с нормальной активностью ПЭ совершен у трех пациенток, клиническая беременность была зафиксирована у одной. У одной пациентки ПЭ был отменен в связи с проведением ПГТ. В группе с высокой активностью овариальной ароматазы беременности диагностированы не были.

Обсуждение

В настоящее время активность ароматазы в тканях определяют различными методами, например, радиометрическим методом, основанным на превращении меченного тритием андростендиона в «тяжелую воду» [18], с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), в том числе ПЦР с обратной транскрип тазой (ОТ-ПЦР) [19, 20]. Для определения количества белка ароматазы Р450 может быть использован Вестерн-блоттинг (белковый блоттинг) [21]. Также экспрессию ароматазы определяют при помощи иммуногистохимического мето да [22, 23]. Вышеперечисленные методики эффек тивны и позволяют точно оценивать актив ность ароматазы р450. Однако недостатком данных методов является необходимость получения биопсийного материала яичника, что требует оперативного вмешательства.

Полученные результаты оценки активности овариальной ароматазы с использованием двух методов позволяют заключить, что коэффициент активности овариальной ароматазы (представляющий собой отношение уровня Э2 к уровню АМГ, вычисляемое на 2-й д. м. ц.) совпадает с активностью этого фермента в крупных полостных фолликулах после стимуляции суперовуляции, оцененной иммуноцитохимическим методом. Высокая корреляционная связь экспрессии ароматазы в кумулюсных клетках пациенток, проходящих протоколы ЭКО с коэффициентом активности ароматазы, позволяет рекомендовать использование гормонального метода как основного в клинической практике, учитывая его точность и неинвазивность.

Оценка активности овариальной ароматазы может отражать качество фолликулогенеза и при ее изменении, вероятно, играть определенную роль при неудачах оплодотворения и имплантации. Известно, что качество ооцита зависит от многих факторов, к одним из которых относятся фолликулярная микросреда, в том числе достаточный уровень эстрадиола в фолликулярной жидкости, наличие адекватной связи между яйцеклеткой и клетками гранулезы, окружающими ооцит [24]. Гранулезные клетки, включая кумулюсные, принимают актив ное участие в дифференцировке фолликулов, что важно для оптимального развития ооцитов, овуляции, оплодотворения и последующей имплантации [25]. Ароматаза присутствует в клетках гранулезы и играет фундаментальную роль в созревании фолликулов и качестве ооцитов [26].

На активность овариальной ароматазы могут влиять различные факторы, отражающие как физиологические, так и патологические состояния.

Полиморфизм гена CYP19 является одной из причин, приводящих к изменению ароматазной активности яичников. Так, при изучении аллельного варианта (ТТТА)n в 4-м интроне гена CYP19, содержащего от 7 до 13 повторов, обнаружено, что наличие более низкого числа повторов (ТТТА)n ассоциировано со снижением ферментативной активности ароматазной активности, а увеличение числа повторов — с повышением активности фермента [13, 27].

Кроме того, ряд гинекологических заболеваний связан с изменением ароматазной активности яичников. При наружном генитальном эндометриозе большинство исследователей сходятся во мнении о снижении экспрессии овариальной ароматазы [19, 28]. При этом некоторые авторы публикуют данные, по которым НГЭ не оказывает существенного влияния на экспрессию гена CYP19A1 в клетках гранулезы яичника [20].

Также дефицит овариальной ароматазы выполняет одну из патогенетических функций при нормогонадотропной ановуляции [22, 29]. Результаты большого числа исследований свидетельствуют о снижении экспрессии ароматазы гранулезных клеток яичников при СПЯ [21, 30]. Все пациентки с СПЯ, участвовавшие в нашем исследовании, также имели сниженную активность овариальной ароматазы. По другим данным, только у половины (48,8 %) больных с СПЯ определяется сниженная ароматазная активность фолликулов, что косвенно отражает патогенетическую неоднородность этого состояния [31]. У пациенток с СПЯ в протоколах ЭКО наличие аллеля CYP19 (TTTA)7, свидетельствующее о снижении ароматазной активности, связано с более низким уровнем Э2 на 3-й д. м. ц., сниженным количеством больших фолликулов при контролируемой овариальной стимуляции (КОС), более низким числом полученных ооцитов, но с более высокими показателями беременности по сравнению с неносителями данного аллеля [32].

У женщин с мужским фактором бесплодия наличие аллеля CYP19 (TTTA)7 ассоциировалось с меньшим числом крупных фолликулов и меньшим числом полученных ооцитов в протоколах ЭКО. Сниженное число фолликулов и полученных ооцитов у аллельных носителей CYP19 (TTTA)7 указывает на возможную связь этого аллеля с более плохим ответом на контролируемую овариальную стимуляцию, и, следовательно, требуется увеличение количества гонадотропинов для достижения аналогичных результатов с неносителями данного аллеля [32]. Altmäe et al. показали, что женщины с более короткими (TTTA)n-повторами имеют меньшие размеры яичников, меньшее число антральных фолликулов и сниженную чувствительность яичников к стандартной стимуляции гонадотропинами [15]. L. Lazaros et al. продемонстрировали, что у пациенток с мужским или трубным фактором бесплодия гомозиготных по коротким аллелям CYP19 (TTTA)n или носителей аллеля CYP19 (TTTA)7 также отмечается меньшее количество растущих фолликулов при КОС по сравнению с женщинами с другими генотипами CYP19, что предполагает связь сниженной ароматазной активности яичников с более слабым ответом в протоколах ЭКО [14].

Таким образом, выявленная по результатам нашего исследования достоверная и высокая корреляционная зависимость между интенсивностью флюоресценции овариальной ароматазы, определяемой при иммуноцитохимическом исследовании клеток кумулюса, и коэффициентом активности ароматазы, вычисляемым по результатам определения эстрадиола и АМГ в крови больных на 2-й д. м. ц., свидетельствует о возможности использования последнего метода для адекватной оценки активности овариальной ароматазы в циклах ЭКО. Дополнительные исследования (увеличение числа обследуемых больных, изучение содержания стероидных гормонов в фолликулярной жидкости, оценка исходов протоколов ЭКО у пациенток с различной активностью овариальной ароматазы) позволят уточнить практическое значение коэффициента активности овариальной ароматазы в прогнозе эффективности протоколов ЭКО.