Features of the epithelial layer formation on corneal graft

Full Text

Сквозная кератопластика является достаточно распространённой операцией, выполняемой с целью зрительной реабилитации. Однако сохраняется вероятность помутнения трансплантата [1–3]. Основными факторами, влияющими на выживаемость трансплантата и визуальную реабилитацию, считаются реакция отторжения, эндотелиальная недостаточность, инфекция [4]. Наряду с этим существенное влияние на выживаемость трансплантата оказывает задержка формирования эпителиального покрова. Длительно существующие либо рецидивирующие дефекты эпителия роговицы доставляют значительный дискомфорт, приводят к развитию инфекционных осложнений и даже потере трансплантата. По мнению исследователей, у 25 % пациентов с подобными осложнениями после кератопластики наблюдается помутнение роговичного трансплантата [5, 6].

Особенность восстановления эпителиального покрова роговичного трансплантата заключается в том, что в отличие от других клеточных структур донорской роговицы эпителизация происходит за счёт миграции клеток хозяина. Однако эпителизация трансплантата не всегда завершается полноценно. В некоторых случаях наблюдаются периодически рецидивирующие эрозии либо происходит замещение роговичного эпителия конъюнктивальным [5, 7, 11]. Следовательно, проблема управления регенерацией поверхностного эпителия роговичного трансплантата остаётся актуальной.

Цель данного исследования — цитологическая характеристика и анализ влияния лекарственных препаратов на формирование эпителиального слоя на трансплантате после кератопластики.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Под наблюдением находились 20 пациентов, которым была выполнена сквозная кератопластика в течение 2018 г. в условиях Самарской областной клинической офтальмологической больницы им. Т.И. Ерошевского. Из них 12 пациентов с буллёзной кератопатией, 8 пациентов с язвой роговицы. Средний возраст пациентов, включённых в исследование, составил 59 лет (27–82 года). Во всех случаях использовали донорский материал, забранный у доноров 25–60 лет в течение 16–20 часов после смерти и хранившийся в среде для консервации при температуре +4 °C не более трёх суток. Донорский материал был классифицирован как «3А» на основании функциональных показателей адреналиновой пробы (скринингового неинвазивного теста) и морфологических показателей биомикроскопической характеристики роговиц по шкале признаков [8]. Все операции выполнял один хирург. Особенностью кератопластики у данных больных являлось ограничение максимального диаметра трансплантата — не более 8,25 мм. В послеоперационном периоде пациенты наряду с антисептическими и стероидными препаратами получали глазные капли, содержащие гиалуронат натрия, в первые дни послеоперационного периода и с 10-го дня — препарат Виксипин, не менее трёх закапываний в день в течение 10–15 дней.

Все больные подвергались стандартному офтальмологическому обследованию как до операции, так и в послеоперационном периоде. Состояние оперированных пациентов контролировали в течение 3 месяцев после операции. Оценивали состояние эпителиального покрова: скорость восстановления, прозрачность, отёчность, отсутствие или периодичность появления рецидивирующих эрозий или точечной эпителиопатии. В разные сроки (2–3-е, 7–10-е и 60–90-е сутки) после сквозной кератопластики были выполнены цитологические исследования. Мазки-отпечатки окрашивали красителем «Лейкодиф 200» (LDF 200) и исследовали под световым микроскопом.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В послеоперационном периоде, у включённых в исследование пациентов, инфекционных осложнений не наблюдалось. Трансплантат был прозрачным на протяжении всего периода наблюдения у 15 больных. В одном случае произошёл лизис трансплантата в течение второго месяца послеоперационного периода, у 4 пациентов наблюдалось полупрозрачное приживление. Улучшение зрения наступило у 11 пациентов из 12, оперированных по поводу буллёзной кератопатии, и четверых пациентов из 8, оперированных по поводу язвы роговицы.

Процесс эпителизации начинался с первых-вторых суток независимо от причины, по которой выполняли кератопластику. Однако эпителизация трансплантата у больных шла не с постоянной скоростью. В течение первых-вторых суток после операции формировалось до двух третей эпителиального покрова, после чего наступало резкое замедление процесса эпителизации и оставался островок деэпителизированной поверхности в центре трансплантата. Центральный дефект покрывался клетками эпителиального слоя в неосложнённых случаях в течение последующих двух-трёх суток. К 8–10-м суткам послеоперационного периода у всех пациентов отмечалось формирование эпителиального слоя на поверхности трансплантата и отсутствие прокрашивания флуоресцеином.

Особенность эпителизации роговичного трансплантата состоит в том, что замещение дефекта идёт путём миграции зрелых клеток роговичного эпителия с краёв эпителиального дефекта. В первую очередь на поверхности эпителиального дефекта фиксируются клетки неправильной многоугольной формы с отростками. Цитоморфологическое исследование на вторые сутки после сквозной кератопластики у пациентки с буллёзной кератопатией показало наличие отдельных длинных отросчатых клеток неправильной формы, пласты более мелких эпителиальных клеток наряду с единичными клетками воспалительного типа — нейтрофилами (рис. 1).

 

Рис. 1. Пациентка А. Диагноз: «OD — буллёзная кератопатия. Вторые сутки после сквозной кератопластики». Окраска Лейкодиф 200 (LDF 200). Увеличение ×400

Fig. 1. Patient A. Diagnosis: Bullous keratopathy of the right eye. Second day after penetrating keratoplasty. Leucodif 200 (LDF 200) stain. Magnification ×400

 

В группе больных, оперированных по поводу язвы роговицы после длительной противовоспалительной терапии, наблюдалась иная картина замещения эпителиального дефекта. В мазке-отпечатке у больного из этой группы на вторые сутки после операции определялось большое количество воспалительных клеток — нейтрофилов и лимфоцитов (рис. 2). Эпителиальные клетки имели округлую форму, были меньше по размеру, с более тёмной цитоплазмой и с большим количеством включений. Наличие клеток с тёмной цитоплазмой и большим количеством включений объясняется активностью воспалительных процессов. Активные клетки продуцируют матриксные металлопротеиназы, приводящие к лизису базальной мембраны и расщеплению межклеточных связей и, как следствие, к десквамации целых пластов эпителиальных клеток. Однако в зоне дефекта эпителия десквамированные эпителиальные клетки не могут фиксироваться на поверхности трансплантата в силу продолжающейся активности матриксных металлопротеиназ [9, 10].

 

Рис. 2. Пациентка Р. Диагноз: «OS — язва роговицы. Вторые сутки после сквозной кератопластики». Окраска Лейкодиф 200 (LDF 200). Увеличение ×400

Fig. 2. Patient R. Diagnosis: Corneal ulcer of the left eye. Second day after penetrating keratoplasty. Leucodif 200 (LDF 200) stain. Magnification ×400

 

Руководствуясь результатами цитоморфологического исследования и анализом ранее выполненных исследований, мы разработали схему послеоперационного лечения данных пациентов. Прежде всего, конечно, в неё вошли нестероидные противовоспалительные препараты и кортикостероиды. Местное применение кортикостероидов подавляет воспаление в тканях переднего сегмента глаза и тем самым уменьшает миграцию воспалительных клеток, способствует ограничению лизиса и восстановлению эпителиального слоя.

В раннем послеоперационном периоде эпителизации роговицы препятствуют такие дополнительные факторы, как денервация роговицы, частое закапывание растворов лекарственных препаратов и истощение регенераторных способностей клеток эпителия. Аномальные клетки не в состоянии быстро мигрировать из базальных в апикальные слои и центрипетально в направлении дефекта. Кроме того, они не способны образовывать прочные межклеточные связи, а значит формировать монослой, что особенно важно в период начала «клинически видимой» эпителизации [12, 13].

С целью создания более благоприятных условий для замещения эпителиального дефекта в комплекс послеоперационного лечения были добавлены глазные капли, содержащие гиалуронат натрия. Образование на поверхности передней пограничной мембраны временной плёнки обеспечивает сохранность гликокаликса и способствует фиксации мигрирующих эпителиоцитов в зоне дефекта.

Мазки-отпечатки с передней поверхности трансплантата на 10–12-й день после кератопластики продемонстрировали эффективность предложенного комплекса послеоперационного лечения, включающего наряду с антисептиками кортикостероиды и препарат, содержащий гиалуронат натрия. У пациентов, оперированных по поводу буллёзной керетопатии, и у пациентов, оперированных по поводу язвы роговицы (рис. 3, 4), на цитограммах этого срока отмечаются более зрелые клетки, характерные для поверхностных слоёв эпителиального покрова, и только единичные нейтрофилы. При биомикроскопии с окраской поверхности роговицы флуоресцеином отсутствовали дефекты эпителиального покрова. При этом сохранялись отёчность и рыхлость эпителия роговицы, которая была более выражена у пациентов с более длительным анамнезом заболевания до кератопластики. С 10-го дня послеоперационного периода в схему лечения были внесены изменения, а именно отменены антибактериальные препараты и назначен препарат Виксипин на последующие 10–15 дней. Виксипин представляет собой комбинированный препарат: наряду с основным действующим веществом — метилэтилпиридинола гидрохлоридом в его составе входит ещё и гиалуронат натрия. Метилэтилпиридинол является ингибитором свободно-радикальных процессов, антигипоксантом и антиоксидантом, повышает содержание циклических нуклеотидов (цАМФ и цГМФ). Повышение уровня цАМФ приводит к уменьшению митозов и подвижности, способствует усилению пролиферативной активности эпителиальных клеток [11], что в свою очередь обеспечивает формирование полноценного многослойного эпителия на трансплантате. Использование производителями циклодекстрина для получения раствора метилэтилпиридинола позволяет повысить терапевтическую эффективность и снизить кратность закапывания до двух раз в день. Наличие натрия гиалуроната наряду с созданием условий на поверхности роговицы для фиксации эпителиальных клеток даёт возможность уменьшить количество закапываемых препаратов и тем самым уменьшить токсическое действие консервантов.

Исследование цитограмм эпителия роговицы через 60 и более суток после кератопластики (рис. 5) у наблюдаемых пациентов подтверждает эффективность препарата Виксипин. При анализе мазков-отпечатков пациентов, оперированных по поводу дистрофических заболеваний роговицы и бактериальных кератитов, не было выявлено значимых различий. На цитограммах представлены единично расположенные зрелые клетки, характерные для поверхностного слоя роговичного эпителия.

 

Рис. 3. Пациентка Р. Диагноз: «OD — буллёзная кератопатия. Десятые сутки после сквозной кератопластики». Окраска Лейкодиф 200 (LDF 200). Увеличение ×400

Fig. 3. Patient R. Diagnosis: Bullous keratopathy of the right eye. 10^th day after penetrating keratoplasty. Leucodif 200 (LDF 200) stain. Magnification ×400

 

Рис. 4. Пациентка Н. Диагноз: «OS — язва роговицы. Десятые сутки после сквозной кератопластики». Окраска Лейкодиф 200 (LDF 200). Увеличение ×400

Fig. 4. Patient N. Diagnosis: Corneal ulcer of the left eye. 10^th day after penetrating keratoplasty. Leucodif 200 (LDF 200) stain. Magnification ×400

 

Рис. 5. Пациент В. Диагноз: «OD — буллёзная кератопатия. 90 суток после сквозной кератопластики». Окраска Лейкодиф 200 (LDF 200). Увеличение ×400

Fig. 5. Patient R. Diagnosis: Bullous keratopathy. 90 days after penetrating keratoplasty. Leucodif 200 (LDF 200) stain. Magnification ×400

 

ВЫВОДЫ

Таким образом, наличие на цитограммах с поверхности роговичного трансплантата на вторые сутки после операции вытянутых отросчатых эпителиоцитов, присутствующих в мигрирующих клетках, позволяет утверждать, что восстановление эпителиального слоя начинается благодаря миграции зрелых эпителиальных клеток с краёв раны собственной роговицы пациента.

Длительно существующий эпителиальный дефект эпителия у пациентов, оперированных по поводу кератитов, вероятно, обусловлен сохранением активности воспалительных агентов в раннем послеоперационном периоде, что объясняет наличие в цитограммах у этих пациентов клеток с тёмной цитоплазмой и большим количеством включений.

Применение противовоспалительной терапии и препаратов, содержащих натрия гиалуронат и антиоксидант, в послеоперационном периоде способствует фиксации мигрирующих эпителиоцитов и, соответственно, формированию полноценного многослойного эпителия, что позволяет рекомендовать Виксипин для лечения больных после кератопластики.

Источники финансирования: Е.С. Милюдин имеет финансовую заинтересованность, источник финансирования — компания «Солофарм».

Конфликт интересов отсутствует.

About the authors

Evgeniy S. Miludin

GBUZ Samara Regional Clinical Ophthalmologic Hospital

Author for correspondence.
Email: miljudin@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7610-7523
SPIN-code: 2034-2910
Scopus Author ID: 7801402280

д-р мед. наук, заведующий отделением, врач-офтальмолог высшей категории

Russian Federation, Samara

Kseniya E. Kuchuk

Samara State Medical University

Email: kuchukke@rambler.ru
SPIN-code: 7785-4779

Ophthalmologist

Russian Federation, Samara

References

Supplementary files