IMMUNOHISTOCHEMICAL ANALYSIS OF LIVER TISSUE IN SPONTANEOUS REGENERATION IN THE RECOVERY PERIOD AFTER EXPERIMENTAL FIBROSIS

Abstract

We investigated the process of spontaneous liver regeneration after chemically induced experimental fibrosis. The obtained data about activity of some liver metalloproteinases, shown important role of each metalloproteinases at different stages of liver recovery.

Full Text

Одним из уникальных свойств печени является ее способность регулировать свой собственный размер и рост. Это свойство определяется основной ролью печени в метаболической регуляции и ее значением в жизни. Для реализации этих функций ткань печени отвечает на воздействие извне организма и на сигналы и метаболические команды, переданные посредством гормонов, цитокинов, факторов роста и нервной регуляции [3]. Общепризнанно, что первое научное описание процесса регенерации печени дали в 1931 г. G.M. Higgins и R.M. Anderson. С этого времени накоплено большое количество данных, свидетельствующих о сложном механизме этого уникального феномена [1, 41. В зрелой печени человека и других млекопитающих обнаружены четыре разновидности стволовых клеток печени -овальные клетки, малые гепатоциты, эпителиальные клетки печени и мезенхимоподобные клетки. Мезенхимоподобные клетки также были получены из зрелой печени человека. Подобно мезенхимальным стволовым клеткам (МСК), данные клетки обладают высоким пролиферативным потенциалом. Наряду с мезенхимальными маркерами (виментин, альфа-актин гладкой мышцы) и маркерами стволовых клеток (Thy-1, CD34), эти клетки экспрессируют гепатоцитарные маркеры (альбумин, CYP3A4, глутатионтрансферазу, СК18) и маркеры дуктальных клеток (CK19). Будучи пересажены в печень иммунодефи-цитных мышей, они образуют мезенхимоподобные функциональные островки человеческой печеночной ткани, вырабатывающие человеческий альбумин, преальбумин и альфа-фетопротеин. Фиброз печения (ФП) является широко распространённым заболеванием. Среди основных причин фиброза печени выделяют хроническую интоксикацию, вирусные гепатиты и неалкогольный сте-атогепатит. Многие годы фиброз печени рассматривался как пассивный и необратимый процесс, приводящий к деструкции печеночной паренхимы и замещению ее богатой коллагеном тканью. В 1970-е гг. впервые стали высказывать предположения, будто выраженный фиброз печени потенциально обратим. Открытие обратимости фиброза печени стало поворотным моментом в области изучения этого процесса и в настоящее время позволяет направить научные исследования на поиски адекватной антифибротической терапии, способной изменить прогноз хро 18 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №3, 2015 г. нических заболеваний печени. Ключевое значение в изучении ФП приобрело открытие клеток Ито, или печеночных звездчатых клеток, также известных как пресинусоидальные и синтезирующие коллаген. В дальнейшем было установлено, что эти клетки могут активизироваться, приобретая способность к фиброгене-зу при хронических заболеваниях печени. Существует два основных компонента, которые ответственны либо за процесс прогрессирования, либо за процесс фиб-ринолиза в тканях печени. Это матрикс-ные металлпротеиназы и их ингибиторы. На сегодняшний день известно 28 типов металлопротеиназ - протеаз, которые ответственны за расщепление экстрацеллю-лярного матрикса [2]. Материалы и методы 1. Моделирование фиброза печени Эксперимент проводили на беспородных белых крысах-самцах весом 220-270 г. Крыс содержали в клетках по 8 особей в каждой в помещениях с искусственным освещением (8.00-20.00ч. - свет, 20.00-8.00 ч. - темнота) при 20-22°С в условиях свободного доступа к воде и пище. Животные были разделены на две группы: контроль и опыт. При моделировании фиброза печени на белых крысах принималось во внимание наличие у них мощной репаративной системы, поэтому первостепенное значение придавалось стойкости фибротических изменений [4, 5]. В связи с этим нами была выбрана модель фиброза с хроническим введением четыреххлористого углерода (ЧХУ) на фоне постоянной алкоголизации. Эксперимент проводили по следующей схеме. За 7 дней до начала введения ЧХУ животным в качестве питья начинали давать 5% вод ный раствор этанола ad libitum. Раствор ЧХУ в растительном масле в соотношении 1:3 вводили внутрижелудочно через зонд дважды в неделю в дозе 0,1 мл/100 г массы тела в течение 8 недель. В течение всего периода индуцирования фиброза печени крысам в качестве питья давали 5% раствор этанола. По данным патогистологического исследования у подопытных животных за 8 недель развивался выраженный фиброз печени с наличием портопортальных и порто-центральных септ и образованием ложных долек (рис. 1А). Степень фиброза печени по шкале METAVIR составляла 3 балла. 2. Иммуногистохимический анализ ткани печени В основе определения активности и локализации исследуемых белков лежит высокоспецифичная реакция антиген (исследуемые белки) - антитело (полученные в лабораторных условиях высоко-очищенные препараты). Реакция визуализируется с помощью включения в комплекс антиген-антитело третьего агента, несущего цветную метку. Эту метку наблюдают под световым микроскопом. При выполнении данного исследования было изучено содержание в ткани печени матриксных металлопротеиназ (ММР) ММР-1, ММР-3, ММР-9 в качестве маркеров активации процесса деградации внеклеточного матрикса (ВКМ). Парафиновые срезы образцов тканей, подлежащих иммуногистохимиче-скому исследованию толщиной 5 мкм монтировали на стекла, обработанные поли-Ь-лизином (“Menzel“). Для определения экспрессии белков применяли следующие антитела (табл. 1). Таблица 1 Основные характеристики антител, применявшихся в экспериментах № п/п Наименование антител Разведение Время экспозиции Фирма-производитель 1 ММР-1 кроличьи поликлональные 1:200 10 минут Spring Bioscience 2 ММР-3 кроличьи поликлональные 1:50 20 минут Spring Bioscience 3 ММР-9 кроличьи поликлональные 1:100 20 минут Spring Bioscience 19 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №3, 2015 г. Для блокирования эндогенной пе-роксидазы срезы инкубировали 20 минут в 3% перекиси водорода. Постановку им-муногистохимических реакций проводили с помощью пероксидазополимерной системы визуализации по стандартному протоколу RE 7150-К “Novocastra“ - модифицированный peroxidase-antiperoxidase (РАР) - метод. Демаскировку антител осуществляли путем кипячения срезов при 100°С в миниавтоклаве Pascal в цитратном буфере с рН = 6,0 в течение 10 минут. Пероксидазу проявляли 3-3-диаминобензидином из набора протокола. На заключительном этапе реакции срезы докрашивали гематоксилином Майера. Негативным контролем служили препараты без инкубации в первичных антителах при полном соблюдении остальных этапов протокола. О специфическом связывании антител с исследуемыми антигенами ММР-1, ММР-9 и ММР-13 свидетельствовало мелкогранулярное дисперсное окрашивание цитоплазмы клеток (темнокоричневого цвета). Крупнозернистый продукт реакции был характерен для ММР-3, TIMP-1 и TIMP-3. Результаты и их обсуждение При изучении внеклеточного матрикса и компонентов соединительной ткани в паренхиме печени интактных животных было отмечено следующее. В очень небольших количествах элементы соединительной ткани обнаруживались только в области портальных трактов. Они были представлены отдельными тонкими короткими волокнами и фибробла-стами, не распространяющимися за пределы триад (рис. 1А). При иммуногисто-химическом исследовании металлопроте-иназ у интактных животных были выявлены следующие характерные черты: - высокий уровень активности ММР-1 (рис. 1Б) у большинства исследуемых животных контрольной группы. Продукт реакции распределялся гетерогенно по печеночным клеткам в виде мелкодисперсного осадка; - фоновая активность ММР-3, определяемая в клетках печени, была высокой. Продукт иммуногистохимической реакции локализовался диффузно в цитоплазме или по периферии гепатоцитов в виде крупных плотно упакованных гранул (рис. 1В); - слабая фоновая активность в гепа-тоцитах ММР-9. Отмечались немногочисленные иммунопозитивные клетки печени, сконцентрированные в центральной части органа по ходу крупных сосудов. Также выявлялась положительная реакция в купферовских и звездчатых клетках (рис. 1Г). Через 8 недель после начала эксперимента при микроскопическом исследовании в ткани печени подопытных животных наблюдали признаки фиброза печени. Имело место формирование порто -портальных и порто-центральных септ и начальные проявления формирования ложных долек. Печеночные клетки, особенно примыкающие к септам, имели признаки стеатоза и баллонной дистрофии. В половине случаев (у 4 из 8 крыс) процесс носил более выраженный характер. Дольковое строение ткани печени было полностью нарушено. Массивные порто-портальные и порто-центральные септы формировали ложные печеночные дольки. В септах наблюдали явления вас-куляризации - образование новых сосудов, шунтирующих кровообращение в дольке. Среди гепатоцитов, находящихся в ложных дольках, отмечали баллонную дистрофию, стеатоз, некротические изменения, а также отдельные митозы. Обращала на себя внимание выраженная дисплазия гепатоцитов - полиморфизм клеток. Подобные изменения свидетельствовали о том, что в данном эксперименте имеет место дальнейшее прогрессирование фиброзного перерождения печени и начало формирования цирроза. По классификации METAVIR - III-IV стадии фиброза (рис. 2А). 20 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №3, 2015 г. В Г Рис. 1. Исследование ткани печени интактных животных. А - Центральная вена печеночной дольки с впадающими в нее синусоидами. Окраска по Masson. Начальное увеличение х85 Б - высокий уровень экспрессии ММР-1 в гепатоцитах интактных животных. Выраженное гетерогенное распределение фермента по печеночным клеткам. ПАП-метод, антитела к ММР-1. Докраска гематоксилином. Исходное увеличение *85 В - Крупногранулярный продукт реакции в цитоплазме гепатоцитов распределен диффузно. В некоторых клетках- по периферии цитоплазмы (показано стрелкой). ПАП-метод, антитела к ММР-3. Докраска гематоксилином. Исходное увеличение *340 Г - Немногочисленные иммунопозитивные гепатоциты и положительная реакция в купферовских и звездчатых клетках. ПАП-метод, антитела к ММР-9. Докраска гематоксилином. Исходное увеличение *85 Через 4 недели после прекращения введения ЧХУ и этанола в течение 8 недель при макроскопическом исследовании отмечали глинистый цвет и неравномерное кровенаполнение органа. При изучении микропрепаратов в ткани печени подопытных животных сохранялись признаки фиброза. Наблюдали порто-порталь-ные и порто-центральные септы, васкуля-ризацию септ, наличие ложных долек (рис. 2Б). Однако следует отметить, что попе речные размеры септ были, как правило, невелики, массивные септы наблюдали редко, признаки стеатоза гепатоцитов были минимальны. Часть септ вместо грубоволокнистой хорошо оформленной структуры имела неясные, как бы размытые контуры, что, по-видимому, свидетельствовало о начале процесса деградации ВМК в ткани печени. По классификации METAVIR изменения в ткани печени расценены как II-III стадии фиброза. 21 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №3, 2015 г. Через 8 недель после начала восстановительного периода при макроскопическом исследовании отмечали измененную окраску органа (глинистого цвета) и неравномерность кровенаполнения по типу «мускатной» печени. При микроскопическом исследовании в ткани печени экспериментальных животных наблюдали пор-то-портальные и порто-центральные фиброзные септы, васкуляризацию септ, наличие ложных долек, стеатоз гепатоци-тов (рис. 2В). Таким образом, через 8 недель восстановительного периода в ткани печени экспериментальных животных по-прежнему наблюдали признаки фиброза печени, отнесенного по классификации METAVIR как II-III стадии. Через 12 недель после начала восстановительного периода в ткани печени подопытных крыс макроскопическая картина печени отличий от контроля не имела. При изучении микропрепаратов наблюдали тонкие фиброзные порто-портальные септы (рис. 2Г). Хорошо просматривалась балочная структура печеночных долек. Порто-центральные септы и ложные дольки не наблюдались. По классификации METAVIR степень фиброза идентифицирована как I. Таким образом, по истечении 12 недель восстановительного периода не происходило полного восстановления в структуре ткани печени и слабо выраженные признаки фиброза охранялись. В Г Рис. 2. Ткань печени крысы, окраска по Masson А - ткань печени крысы через 8 недель после начала эксперимента. Внутрижелудочное введение ЧХУ и этанола. Исходное увеличение х120 Б - Восстановительный период 4 недели после 8 недель внутрижелудочного введения ЧХУ и этанола. Исходное увеличение х120 В - Восстановительный период 8 недель после 8 недель внутрижелудочного введения ЧХУ и этанола. Исходное увеличение х170 Г - Восстановительный период 12 недель после 8 недель внутрижелудочного введения ЧХУ и этанола. Исходное увеличение х170 22 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №3, 2015 г. Через 8 недель после начала введения ЧХУ и 5% этанола по данным гистохимического исследования в ткани печени уровень экспрессии ММР-1 соответствовал контрольным значениям (рис. 3А). При исследовании металлопротеиназ через 4 недели после начала периода восстановления после 8 недель введения ЧХУ и 5% этанола было выявлено отсутствие изменения экспрессии ММР-1 по сравнению с контролем (рис. 3Б). Сохранялось гетерогенное распределения фермента по парен химе печени. По данным иммуногистохи-мического исследования в ткани печени через 8 недель после начала восстановительного периода фоновое повышение уровня экспрессии ММР-1 преимущественно в центральной части фиброзных септ в 50% исследуемых случаев (рис. 3В). При иммуно-гистохимическом исследовании металло-протеиназ через 12 недель восстановительного периода изменений активности ММР-1 по сравнению с контрольными значениями обнаружено не было (рис. 3Г). В Г Рис. 3. Иммуногистохимическое исследование ткани печени ПАП-метод, антитела к ММР-1. Докраска гематоксилином А - Ткань печени крысы через 8 недель после начала эксперимента. Исходное увеличение *340 Б - Восстановительный период 4 недели после 8 недель внутрижелудочного введения ЧХУ и этанола. Исходное увеличение *85 В - Восстановительный период 8 недель после 8 недель внутрижелудочного введения ЧХУ и этанола. Иммунопозитивные гепатоциты, расположенные центролобулярно. Исходное увеличение *85 Г - Восстановительный период 12 недель после 8 недель внутрижелудочного введения ЧХУ и этанола. Исходное увеличение *85 23 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №3, 2015 г. Через 8 недель после начала введения ЧХУ и 5% этанола по данным имму-ногистохимического исследования уровень экспрессии ММР-3 соответствовал контрольным значениям. Гепатоциты с продуктом реакции ММР-3 в виде крупных гранул располагались преимущественно вдоль фиброзных септ (рис. 4А). При иммуногистохимическом исследовании металлопротеиназ через 4 недели после начала периода восстановления уровень экспрессии ММР-3 проявлял тенденцию к снижению по сравнению с контрольными значениями (рис. 4Б). Через 8 недель после начала восстановительного периода при иммуногистохимическом ис следовании был выявлен продукт реакции антиген-антитело к ММР-3 в виде крупных гранул, он концентрировался в пери-синусоидальных пространствах в отростках звездчатых клеток, расположенных вдоль печеночных балок. Отмечалось наличие положительной реакции в ядрах гепатоци-тов (рис. 4В). При иммуногистохимическом исследовании металлопротеиназ через 12 недель восстановительного периода уровень экспрессии ММР-3 незначительно превышал контрольные значения. Гепато-циты с многочисленными крупными гранулами коричневого цвета располагались преимущественно периваскулярно и вдоль фиброзных тяжей (рис. 4Г). В Г Рис. 4. Иммуногистохимическое исследование ткани печени ПАП-метод, антитела к ММР-3. Докраска гематоксилином А - ткань печени крысы через 8 недель после начала эксперимента. Внутрижелудочное введение ЧХУ и этанола. Продукт иммуногистохимической реакции в виде крупных гранул в цитоплазме гепатоцитов, расположенных вдоль фиброзных тяжей. Исходное увеличение х340 Б - Восстановительный период 4 недели после 8 недель внутрижелудочного введения ЧХУ и этанола. Исходное увеличение х340 В - Восстановительный период 8 недель после 8 недель внутрижелудочного введения ЧХУ и этанола. Перисинусоидальное расположение гранул ММР-3 и положительная реакция в ядрах гепатоцитов. Исходное увеличение х340 Г - Восстановительный период 12 недель после 8 недель внутрижелудочного введения ЧХУ и этанола. Исходное увеличение х340 24 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №3, 2015 г. Через 8 недель после начала введения ЧХУ и 5% этанола при иммуноги-стохимическом исследовании металло-протеиназы 9 был выявлен уровень активности ММР-9, превышающий контрольные значение в среднем в 1,5 -2 раза. Многочисленные иммунопозитивные клетки (некоторые из них, предположительно, тучные клетки) располагались вдоль фиброзных тяжей, а также были рассеяны по паренхиме органа (рис. 5А). При иммуногистохимическом исследовании металлопротеиназ через 4 недели после начала периода восстановления после 8 недель введения ЧХУ и 5% этанола был выявлен сниженный уровень экспрессии ММР-9 по сравнению с контрольными значениями. Продукт положительной иммуногистохимической реакции на ММР-9 определялся в немногочисленных гепатоцитах, расположенных периваскулярно (рис. 5Б). В Г Рис. 5. Иммуногистохимическое исследование ткани печени ПАП-метод, антитела к ММР-9. Докраска гематоксилином А - ткань печени крысы через 8 недель после начала эксперимента. Внутрижелудочное введение ЧХУ и этанола. Иммунопозитивные клетки с высокой экспрессией, расположенные вдоль фиброзных тяжей. Исходное увеличение *340 Б - Восстановительный период 4 недели после 8 недель внутрижелудочного введения ЧХУ и этанола. Исходное увеличение *340 В - Восстановительный период 8 недель после 8 недель внутрижелудочного введения ЧХУ и этанола. Исходное увеличение *85 Г - Восстановительный период 12 недель после 8 недель внутрижелудочного введения ЧХУ и этанола. Исходное увеличение *85 25 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №3, 2015 г. По данным иммуногистохимическо-го исследования содержания нейтральных липидов в ткани печени через 8 недель после начала восстановительного периода было обнаружено снижение активности ММР-9. Положительная реакция регистрировалась в виде мелкодисперсного осадка, рассеянного по цитоплазме печеночных клеток. Также отмечалось появление гепатоцитов с иммунопозитивными ядрами. (рис. 5В). При иммуногистохи-мическом исследовании металлопротеи-наз через 12 недель восстановительного периода изменений активности ММР-9 по сравнению с контрольными значениями обнаружено не было (рис. 5Г). Выводы Данные иммуногистохимического исследования показали, что в первую фазу восстановления структуры печени решающую роль имеет активность метал-лопротеиназы - 9, которая резко возрастает непосредственно в момент фиброге-неза, а затем резко снижается. В период с 4 по 8 неделю восстановления печени возрастает активность металлопротеина-зы - 1. Далее с 8 по 12 неделю восстановления печени возрастает активность ме-таллопротеиназы - 3. Таким образом в процессе спонтанной регенерации печени при фиброзе активно участвуют все три, исследованные нами металлопротеиназы, включаясь в этот процесс поочередно.