METHODS OF IDENTIFICATION OF DRUGS AS P-GLYCOPROTEIN SUBSTRATES

Cover Page

Abstract


The article presents an original method for determining belonging of drugs to the substrates of the transport protein P-glycoprotein (Pgp). This methodics is based on a comparison of the pharmacokinetic parameters of the test substrate before and after a course of administration of the inductor (rifampicin) and inhibitor (verapamil) of the transport protein. If the content of test substance in organism is reduced after Pgp inductor administration, and increased after the inhibitor administration, we conclude that this substance is Pgp substrate. For approbation of developed technique we examined by blind method the pharmacokinetics of fexofenadine - known Pgp substrate at a dose of 67,5 mg/kg, before and after the 14-days administration of rifampicin (40 mg/kg twice daily) and verapamil (a daily dose of 20 mg/kg three times a day). It was revealed that after a course administration of verapamil maximum concentration of fexofenadine, its area under the concentration-time curve and half-life were significantly increased, as well as the time of maximum concentration was decreased. In contrast, rifampicin course administration resulted in a decrease in the area under the curve concentration-time and an increase in total clearance of marker substrate of Pgp, wich proves the adequacy of methods.

Full Text

В фармакокинетике лекарственных веществ (ЛВ) кроме ферментных систем, участвующих в их биотрансформации, большая роль принадлежит транспортным белкам, обеспечивающим выведение ЛВ из организма или препятствующим их всасыванию и проникновению через тканевые барьеры. Наиболее изученным транспортером является гликопротеин-P (Pgp) -мембранный белок, удаляющий из клеток во внеклеточное пространство или просвет органов широкий спектр эндогенных и экзогенных субстратов, среди которых -большое число лекарственных веществ с различной химической структурой и механизмом действия [9]. Pgp локализован преимущественно на апикальной мем бране клеток слизистой оболочки тонкого кишечника, гепатоцитов, эпителиоцитов проксимальных канальцев нефронов почек и эндотелиоцитов гистогематических барьеров. В связи с особенностями локализации от функциональной активности Pgp в значительной степени зависит фармакокинетика лекарственных веществ, являющихся его субстратами, и, следовательно, эффективность и безопасность фармакотерапии. Функционирование белка-транспортера может быть как индуцировано, так и ингибировано под действием различных факторов внешней и внутренней среды [3], в том числе и при приеме ряда лекарственных средств [4]. При этом высокая активность транспортера ведет к 49 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №3, 2015 г. неэффективности фармакотерапии веществом-субстратом, а низкая активность - к его относительной передозировке. В связи с вышеизложенным целью работы явилась разработка методики анализа принадлежности лекарственных средств к числу субстратов Pgp. Материалы и методы Работа выполнена на 12 половозрелых кроликах-самцах породы Шиншилла массой 3500 - 4300 г. Работа с животными проводилась в соответствие с правилами лабораторной практики (Приложение к приказу Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 года 708н). Животным вводили фексофенадин (таблетки покрытые оболочкой Телфаст, 180 мг, Aventis Pharma, Италия) однократно внутрижелудочно в дозе 67,5 мг/кг массы [1], затем забирали у них кровь из ушной краевой вены в объеме 5 мл в ге-паринизированные пробирки, после чего центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин для получения плазмы. В плазме крови определяли концентрацию фексофенадина методом ВЭЖХ на хроматографической системе «Stayer» по методике, описанной ранее [2]. Затем животные были разделены на две серии: первая серия (n=6) получала рифампицин (капсулы Рифампицин, 150 мг, РУП «Белмедпрепараты», Республика Беларусь) в дозе 40 мг/кг дважды в день [7] в течение 14 дней, вторая серия (n=6) получала верапамил (таблетки, покрытые обо лочкой, 80 мг, Валента Фармацевтика ОАО, Россия) в дозе 20 мг/кг в сутки в три приема [1] аналогичным курсом. Затем животным двух серий снова вводили фексофенадин и анализировали его фармакокинетику. Эксперимент выполнен «слепым» методом. Введение препаратов (рифампицина и верапамила), забор крови и определение концентрации фексофенадина методом ВЭЖХ выполняли разные исследователи после специальной маркировки препаратов и проб крови для выполнения условий «ослепления». Фармакокинетические параметры рассчитывали, используя модельнонезависимый метод, с применением программы «Kinetica 5.0». Для статистической обработки данных применяли офисный пакет «Microsoft Office XP» и программу Statistica 7.0. При статистической обработке результатов характер распределения данных оценивали по критерию Шапиро-Уилка. Наличие статистически достоверных межгруп-повых различий определяли по критерию Ньюмена-Кейлса после проведения дисперсионного анализа повторных измерений (тест ANOVA - для показателей, имеющих нормальное распределение, критерий Фридмана - для показателей, распределение которых отличалось от нормального). Результаты считали достоверными при уровне значимости меньше 0,05. Результаты и их обсуждение Полученные результаты представлены в таблицах 1 и 2. Таблица 1 Основные фармакокинетические параметры фексофенадина Фармакокинетические параметры Интактные кролики (n=6) После введения верапамила (n=6) Р Cmax нг/мл 673,43±370,67 1012,27±252,67 0,014 AUC0.t, нг*ч/мл 5256,65±4024,58 8064,62±2145,95 0,031 AUC0.«, нг*ч/мл 6216,16±5611,39 11104,14±3353,63 0,011 Tmax ч 5,5 (2,5; 6,0) 2,0 (1,75; 2,5) 0,042 Т1/2, ч 6,4±2,5 13,75±5,65 0,024 MRT, ч 9,72 (8,2; 12,48) 18,4 (13,0; 22,7) 0,116 Cl, л/ч 54,42±44,83 17,47±5,05 0,075 Объем распределения, л 527,51±456,7 305,05±104,63 0,307 Примечание: данные представлены в виде среднего арифметического и стандартного отклонения среднего арифметического (M±SD) в случае их нормального распределения и медианы, нижнего и верхнего квартилей (Med, lq, uq) - в случае распределения отличного от нормального. 50 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №3, 2015 г. На фоне курсового введения вера-памила наблюдалось достоверное повышение максимальной концентрации (Сшзх) фексофенадина на 50,3% (p = 0,014), площади под фармакокинетической кривой концентрация-время (AUC0-t) на 53,4% (p = 0,031), периода полувыведения (Тід) на 114,8% (p=0,024), а также сниже ние времени достижения максимальной концентрации (Tmax) на 63,6% (p = 0,042). Напротив, курсовое введение кроликам рифампицина приводило к снижению площади под фармакокинетической кривой концентрация-время (AUC0-t) фексофенади-на на 61,2% (p = 0,042) и увеличению общего клиренса (Cl) на 130,2% (p = 0,038). Таблица 2 Основные фармакокинетические параметры фексофенадина до и после введения рифампицина Фармакокинетические параметры Интактные кролики (n=6) После введения рифампицина (n=6) p Сшах, нг/мл 909,89±449,42 506,12±459,05 0,155 AUC0-t, нг*ч/мл 5276,73±2955,84 2049,60±957,59 0,042 AUC0_„ нг*ч/мл 5958,31±3236,25 2308,89±914,97 0,035 Тшэх, Ч 4,0 (2,5; 5,25) 3,0 (2,0; 3,75) 0,357 Т1/2, ч 7,51±5,52 4,90±2,29 0,342 HRT, ч 10,47±4,07 9,35±3,53 0,650 Cl, л/ч 41,49±26,42 95,5±57,32 0,038 Объем распределения, л 367,71±150,83 861,62±468,77 0,074 Примечание: данные представлены в виде среднего арифметического и стандартного отклонения среднего арифметического (M±SD) в случае их нормального распределения и медианы, нижнего и верхнего квартилей (Med, lq, uq) - в случае их распределения отличного от нормального. Фексофенадин - это гистаминолитик III поколения, который не метаболизирует-ся в организме, а его всасывание в кишечнике, распределение и элиминация напрямую зависят от функционирования Pgp. Поэтому данный лекарственный препарат может служить маркерным субстратом, отражающим функциональную активность данного белка-транспортера [1, 8]. Верапамил в ряде исследований продемонстрировал свою способность ингибировать функциональную активность Pgp, предположительно, связываясь с его молекулой и нарушая ее контакт с субстратами транспортера [1, 5]. Рифампицин повышает функциональную активность Pgp путем активации транскрипционного фактора PXR, который связывается с промотором гена, кодирующего данный транспортер, и повышает его экспрессию [6]. Выявление зависимости фармакокинетики лекарственного вещества от Pgp позволяет корректировать его дозу с учетом индивидуальной функциональной активности транспортера. Подобную тактику уже рекомендуют американские организации FDA (Food and Drug Administration), U.S. Department of Health and Human Services, Center for Drug Evaluation and Research. Продемонстрированная в данной работе динамика параметров фармакокинетики фексофенадина, который был выбран в качестве эталонного субстрата Pgp, после курсового введения рифампицина и верапамила доказывает пригодность использования указанных индуктора и ингибитора активности транспортера, курсов их введения и доз для тестирования лекарственных средств на принадлежность к субстратам Pgp. Выводы 1. Введение кроликам породы шиншилла верапамила в суточной дозе 20 мг/кг массы три раза в сутки в течение 14 дней вызывает снижение функциональной активности гликопротеина-Р, что позволяет использовать препарат в качестве ингибитора для оценки принадлеж 51 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №3, 2015 г. ности лекарственных средств к числу субстратов гликопротеина-P. 2. Введение кроликам породы шиншилла рифампицина в дозе 40 мг/кг массы два раза в день в течение 14 дней вызывает повышение функциональной активности гликопротеина-Р, что позволяет использовать препарат в качестве индуктора для оценки принадлежности лекарственных средств к числу субстратов гликопротеина-P. 3. Разработанная методика оценки принадлежности лекарственных средств к числу субстратов гликопротеина-P основана на сравнении фармакокинетических параметров тестируемого субстрата до и после курсового введения индуктора и ингибитора данного белка-транспортера.

About the authors

E N Yakusheva

Email: e.yakusheva@rzgmu.ru

I V Chernykh

Email: Ivchernykh88@mail.ru

A V Shulkin

Email: alekseyshulkin@rambler.ru

M V Gatsanoga

Email: Ivchernykh88@mail.ru

References

  1. Колхир С.В. Клиническое значение изучения активности транспортера лекарственных средств гликопротеина-Р для оптимизации фармакотерапии: автореф. дис.. канд. мед.наук: 14.03.06 / С.В. Колхир; ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова. - М., 2007. - 21 с.
  2. Функциональная активность и экспрессия гликопротеина-P при экспериментальных манипуляциях / Е.Н. Якушева [и др.] Российский медикобиологический вестник им. акад. И.П. Павлова. - 2014. - №2. - С. 75-78.
  3. Якушева Е.Н. Влияние экспериментальной подострой гипобарической гипоксической гипоксии на функциональную активность гликопротеина-P / Е.Н. Якушева, И.В. Черных // Российский медико-биологический вестник им. акад. И.П. Павлова. - 2013. -№1. - С. 60-64.
  4. Binkhathlan Z. P-glycoprotein Inhibition as a Therapeutic Approach for Overcoming Multidrug Resistance in Cancer: Current Status and Future Perspectives / Z. Binkhathlan, A. Lavasanifar // Curr. Cancer Drug Targets. - 2013. - Vol. 13, №3. - P. 326-346.
  5. Carrigos M. Competitive and Non-Competitive Inhibition of the Multidrug-Resistance-Associated P-glycoprotein ATPase / M. Carrigos, L.M. Mir, S. Orlowski // Eur. J. Biochem. - 1997. - Vol. 244, №2. - P. 664-673.
  6. Casein Kinase 2 (CK2)-mediated Phosphorylation of Hsp90ß as a Novel Mechanism of Rifampin-induced MDR1 Expression / S.W. Kim [et al.] // J. Biol. Chem. - 2015. - Vol. 290, №27. - P. 17029-17040.
  7. Comparative evaluation of tigecycline and vancomycin, with and with out rifampicin, in the treatment of methicillin-resistant Staphylococcus aureus experimental osteomyelitis in a rabbit model / L.Y. Yin [et al.] // J. Antimicrob. Chemother. - 2005. - Vol. 55, №6. - P. 995-1002.
  8. Design of Fexofenadine Prodrugs Based on Tissue-Specific Esterase Activity and Their Dissimilar Recognition by P-Glycoprotein / K. Ohura [et al.] // J. Pharm. Sci. - 2015. - Vol. 104, №9. - P. 3076-3083.
  9. Montanari F. Prediction of drug-ABC-transporter interaction - Recent advances and future challenges / F. Montanari, G.F. Ecker // Adv. Drug. Deliv. Rev. - 2015. - Vol. 86. - P. 17-26.

Statistics

Views

Abstract - 347

PDF (Russian) - 200

PlumX

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2015 Yakusheva E.N., Chernykh I.V., Shulkin A.V., Gatsanoga M.V.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies