Significance of immunohistochemistry method for diagnosing of stomach tumors

Full Text

Опухоли желудка (ОЖ), являющиеся одними из наиболее распространенных новообразований населения Восточной Европы, включают в себя широкий спектр различных по гистогенезу опухолей, чей прогноз зависит от генерализации процесса, правильно поставленного диагноза и подобранного лечения [3, 4, 5, 6, 8, 10]. Существуют многочисленные гистологические классификации ОЖ, но ни одна не является достаточно удовлетворительной в плане прогноза на первичном этапе диагностики. Иммуногистохимическое исследование (ИГХ) позволяет значительно повысить диагностическую и экономическую эффективность исследования опухолей человека [2], особенно анапластических со стертой морфологической картиной, а определение пролиферативной активности приобретает особое значение в диагностики различных групп ОЖ [2, 4]. Материалы и методы Для исследования был отобран материал 62 пациентов (36 женщин и 26 мужчин) в возрасте от 24 до 78 лет (средний возраст 59+3, медиана 61), которые на протяжении 2012-2013 гг. обращались с целью уточнения патогистологического диагноза ОЖ для проведения дополнительного ИГХ исследования на базе морфологического отдела Диагностического центра Медицинской Академии г. Днепропетровска. Использовались формалин-фиксированные и парафин-зали-тые экземпляры биопсийного материала. Перечень первичных моноклональных антител (TermoScientific, США) для ИГХ (табл. 1). Для идентификации реакций использовалась система визуализации Quanto (Termo-Scientific, США), хромоген DAB. Индекс пролиферации (ИП) определялся процентом опухолевых клеток с Ki-67-позитивной реакцией. Интенсивность цитоплазматической, ядерно-цитоплазматической и мембранной реакций оценивалась как слабая (+), умеренная (++), сильная (+++). Статистическая обработка данных проводилась в программе SPSS Statistica 17.0. Сравнение средних значений осуществлялось по критерию Стьюдента. Значимой считалась связь при р<0,05. 15 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №4, 2014 г. Таблица 1 Первичные моноклональные антитела Первичные антитела Клон (разведение) Локализация специфической реакции Сytokeratin, Рan АЕ1/АЕ3(1:200) Цитоплазма Cytokeratin 7 (СК7) OV-TL 12/30 (1 100) Цитоплазма Ki-67 SP6 (1:200) Ядро S100 4C4.9 (1:700) Ядерно-цитоплазматическая Vimentin V9 (1:250) Цитоплазма CD34 QBEnd 10 (1:100) Мембрана, цитоплазма CD20 L26 (1:500) Мембрана, цитоплазма ОТ79а SP18 (1:500) Мембрана, цитоплазма CD3 SP7 (1:500) Цитоплазма CD117 ab-1(1:200) Цитоплазма, мембрана DOG1 SP31 (1:100) Цитоплазма, мембрана Chromogranin A LK2H10 (1:100) Цитоплазма, мембрана Synaptophysin SYP02 (1:300) Цитоплазма, мембрана Результаты и их обсуждение Согласно классификации ВОЗ все диагностируемые нами ОЖ были разделены на две группы (1) эпителиальные и (2) неэпителиальные [5, 10]. В группе (1): 19 случаев недифференцированных раков желудка (НРЖ), 9 аденокарцином желудка (АЖ), 4 карци-ноида (высокодифференцированного нейроэндокринного рака (НЭР) и 5 низкодифференцированных НЭР. В группу (2) ОЖ были отнесены: 13 гастроинтестинальных стромальных опухолей (ГИСО), 11 лимфом (в том числе 1 лим-фома Беркитта) и 1 липосаркома. Первичные диагнозы ОЖ после стандартной окраски гематоксилин-эозин (Г-Э) представлены в таблице 2. Таблица 2 Совпадение первичных патогистологических диагнозов опухолей желудка и после проведения ИГХ Первичный патогистологический диагноз n (%) Совпадение диагнозов после проведения ИГХ, n (%) 1. Карцинома 28 (45,2%) 19 из 28 (67,9%) 2. ГИСТ 7 (11,3 %) 7 из 7 (100%) 3. Лимфома 5 (8,0%) 3 из 5 (60%) 4. Лейомиома 4 (6,4%) 0 из 4 (0%) 5. Карциноид 3 (4,9%) 0 из 3 (0%) 6. Гиперплазиогенный полип 3 (4,9%) 0 из 3 (0%) 7. Неврилеммома 1 (1,6%) 0 из 1 (0%) 8. ? 11 (17,7%) - Примечание: в группу карцином после ИГХ вошли АЖ, НРЖ, НЭР Согласно Laurén’s классификации аденокарциномы относятся к «intestinal» типу карцином желудка [5, 6, 10] и представляют собой большую часть наблюдений злокачественных новообразований этой локализации. В нашем исследовании выявлены 7 АЖ низкой и 2 - умеренной степени дифференциации (в 5 случаях был предположен НРЖ, 2 - ?, 1 - лимфома и 1 - карциноид, что и послужило поводом для ИГХ). Все они показали позитивную реакцию на Сytokeratin, Рan (рис. 1 А), негативную на Vimentin и хотя бы частично окрашивались СК7. ИП колебался в пределах 28% - 54% (среднее значение 34+2%, медиана 36%) (рис. 1 Б). Оказалось, что сложность для диагностики представили случаи АЖ с 16 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №4, 2014 г. обильной лимфоидной стромой, симулирующие лимфому, и плохо изготовленные препараты. Тонкие срезы с Сytokeratin, Рan четко демонстрируют тубулярные или папиллярные структуры АЖ (рис. 1 А), что позволяет обнаружить «intestinal» тип, вместо «diffuse» типа НРЖ, выставленного при окраске Г-Е. Анализ 19 случаев НРЖ показал широкое разнообразие морфологических «diffuse» типов: 4 перстневидноклеточных, где более 50% клеток ОЖ содержали в своей цитоплазме вакуоли с муцином (рис. 1 В), 2 случая редких крупноклеточных НРЖ с массивной нейтрофильной инфильтрацией (Fletcher Ch. (2013) ссылается на 5 подобных случаев, и связывает этот феномен с выработкой опухолевыми клетками I1-8 и с лучшим прогнозом, особенно у женщин [5]), 3 медуллярных НРЖ с лимфоидной инфильтрацией, 6 мелкоклеточных НРЖ с выраженной стромой, 4 - крупноклеточных НРЖ с эозинофильной цитоплазмой атипичных клеток и агрессивным инфильтративным ростом. Несмотря на сложность диагностики, первично в 14 (73,7%) случаях был выставлен НРЖ (остальные в 2 - ?, 1 -лимфома, 1 - лейомиома и 1 - гастрит, вероятно из-за скудности материала). Все случаи НРЖ, как и АЖ имели фенотип Сytokeratin, Рan «+» (рис. 1 В), Vimentin «-» и хоть частично СК7 «+». ИП варьировал от 21% до 68% (среднее значение 38+4%, медиана 37%) (рис. 1 Г). Таким образом, при наличии злокачественной ОЖ, наиболее частым предположительным диагнозом становится НРЖ (и хотя в 73,7% этот диагноз был оправдан, в 13 случаях наших наблюдений после ИГХ диагноз НРЖ удалось либо опровергнуть, либо найти направление дифференцировки клеток, например, НЭР или АЖ). Иммунофенотип и ИП не могут служить дифференциальными критериями в диагностике АЖ и НРЖ, необходимо основываться на структурных особенностях «diffuse» типов, которые чаще всего представлены разобщенными клетка ми, потерявшими гомотипическую межклеточную адгезию (редукция экспрессии Е-кадгерина) [2, 3, 4, 5, 10], что приводит к значительной инфильтрации с проникновением опухоли через все слои желудочной стенки и хорошо выявляется при окрашивании Сytokeratin, Рan. Группа НЭР высокой (5 случаев) и низкой (4 случая) степени дифференциации отличались от других карцином дополнительными положительными реакциями на маркеры нейроэндокринной дифференцировки Chromogranin A + и/или Synaptophysin + с не всегда равномерным окрашиванием Сytokeratin, Рan (рис. 1 Д). Для карциноидов ИП насчитывал от 2 до 18% (среднее значение 8+1%, медиана 4%) (рис. 1 Е), для низкодифференцированных НЭР - от 32% до 74% (среднее значение 53+4%, медиана 53%). Таким образом, наиболее типичный фенотип НЭР желудка Сytokeratin, Рan «+» (рис. 1 Д), Chromogranin A «+» и/или Synaptophysin «+», Vimentin «-». Экспрессия СК7 имела непостоянный характер (только в 2 карциноидах из 9 (22,2%) всех НЭР была позитивная реакция). ИП отражает степень дифференциации НЭР и является надёжным прогностическим фактором [8, 9]. Безусловно, наибольшей по численности группой неэпителиальных ОЖ стали ГИСО (13 случаев), диагностика которых требует ИГХ из-за наличия таргетной терапии (в случае CD117 «+» опухолей). Среди них можно выделить 2 морфологических варианта: веретеноклеточный (ВВ), n=7, из веретеновидных клеток с удлиненными ядрами и эозинофильной цитоплазмой, которая может содержать одну парануклеарную вакуоль (рис. 2 А), и эпителиоидный (ЭВ), n=6, состоящий из круглых вакуолизированных клеток, собранных гнездами, что напоминает «эпи-телиоидную» картину (рис. 2 Б). Клеточный плеоморфизм в обоих вариантах был непосредственно связан с высоким злокачественным потенциалом (ИП более 5%) [5, 6, 7], таких наблюдений оказалось 4 из 13 (30,8%) (рис. 2 Д). В общем, ИП коле 17 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №4, 2014 г. Рис. 1. А. Умереннодифференцированная АЖ, сильная (+++) реакция с Cytokeratin, Рап (х400). Б. ИП на уровне 48% (х400). В. Перстневидноклеточный НРЖ, сильная (+++) реакция с Cytokeratin, Рап (х400). Г. ИП на уровне 32% (х400). Д. НЭР желудка, неравномерное окрашивание Суіокегайп, Рап (х400). Е. ИП на уровне 11% (х400) бался в пределах 2% - 16% (среднее значение 7+2%, медиана 5%). Позитивная реакция CD 117 определилась в 11 из 13 (84,6%) ГИСО (рис. 2 В). В остальных случаях диагноз удалось поставить благодаря экспрессии не менее специфичного маркера DOG1 (позитивная реакция в 12 из 13 (92,3%) наблюдений (рис. 2 Г). Также 11 из 13 (84,6%) ГИСО окрашивались CD34 (рис. 2 Е), и только 1 из 13 (7,7%) - S100, что совпадает с данными других исследователей [4, 5, 7, 8, 10]. При оценке первичных диагнозов, оказалось, что из 13 ГИСО большая часть (n=7) была диагностирована верно, остальные: 3 - лейомиомы, 1 - невриле-момма, 1 - рак и 1 - ? 18 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №4, 2014 г. Рис. 2. ГИСО. А. ВВ, окраска Г-Е (х400). Б. ЭВ, окраска Г-Е (х400). В. ВВ, сильная (+++) реакция с CD117 (х400). Г. ЭВ, умеренная (++) реакция с DOG1 (х400). Д. ВВ, ИП на уровне 16% (высокий злокачественный потенциал) (х400). Е. ЭВ, умеренная (++) реакция с CD34 (х400) Таким образом, фенотип ГИСО желудка CD 117 «+/-», DOG1 «+/-», CD34 «+/-», а ИП отражает злокачественный потенциал. Следующая большая группа неэпителиальных ОЖ - это лимфомы (11 наблюдений). Прежде всего, нужно отметить их крайне высокую пролифератив ную активность (среднее значение ИП 75+3%, медиана 81%), исключение составил 1 случай мальтомы, где ИП был всего 23%. Его можно отнести скорее к лимфоэпителиальным поражениям с необходимостью антихеликобактерной терапии и наблюдением в динамике. Остальные случаи были представлены 9 диффузны 19 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №4, 2014 г. ми В-клеточными крупноклеточными лимфомами, для фенотипа которых характерна экспрессия пан-В-клеточных антигенов CD20, CD79a в светлых опухолевых клетках по типу «центроцитов» с негативной экспрессией Т-клеточного антигена CD3, и одной лимфомой Беркитта с экспрессией тех же антигенов, но специфической морфологией напоминающей «звездное небо». Интересно, что только 3 из 11 (27,3%) первичных диагнозов были верны (4 - раки, 4 - ?). Степень зрелости и злокачественности MALT лимфом желудка обсуждается в литературе, склоняясь к благоприятному прогнозу при своевременной антихе-ликобактерной терапии [1, 4, 5]. Но также говорят о наиболее частой трансформации MALT лимфом именно в диффузную В-клеточную крупноклеточную лимфому [1, 10], что и подтвердилось в нашем исследовании. Агрессивность исследуемых нами образцов подтверждается высокой пролиферативной активностью и глубиной проникновения (поражение подсли-зистой в 10 ОЖ). Липосаркома достаточно редкая ОЖ, но с характерной морфологической картиной жировой ткани. Фенотип такой мезенхимальной опухоли характеризуется Сytokeratin, Рап «-», Vimentin «+» в отличие от карцином и S100 «+». ИП единственного наблюдения составил 7%. Выводы ИГХ метод крайне важен для диагностики опухолей желудка, что подтверждают неверные первичные диагнозы в 33 из 62 случаев (53,2%), выставленные после рутинного гистологического окрашивания гематоксилином и эозином, во всех исследованных нами группах опухолей желудка. Индекс пролиферации является важным фактором для определения потенциала злокачественности гастроинтестинальных стромальных опухолей и степени дифференцировки нейроэндокринного рака, а также вспомогательным ориентиром трансформации лимфоэпителиального поражения слизистой желудка при хеликобактерной инфекции в диффузную В-клеточную лимфому.

References

Supplementary files