Оценка биологической эффективности аминокислотной смеси как потенциального стимулятора синтетических процессов в скелетных мышцах

Полный текст

В настоящее время значительное место среди фундаментальных исследований, посвященных поиску средств стимуляции мышечного анаболизма, занимают работы по применению в качестве стимуляторов низкомолекулярных соединений и, прежде всего, аминокислот [1, 2]. Так, многочисленные модельные эксперименты свидетельствуют о значительном анаболическом эффекте по отношению к мышцам дополнительного приема как отдельных аминокислот, так и их смесей [35]. При этом отмечено, что наибольшим эффектом в направлении стимуляции мышечного анаболизма обладают аминокислоты с разветвленным углеводородным радикалом [6, 7]. Среди аминокислот этой группы максимальная анаболическая активность обнаруживается у лейцина [8]. Для стимуляции положительного азотистого баланса также продемонстрирована эффективность перорального применения аргинина [9]. Синтез белка в мышцах в разной степени стимулировал дополнительный прием фенилаланина [10], глутамина [11], метионина [12], также изучается анаболическое действие дипептидов [13].

Таким образом, фундаментальными исследованиями доказана способность отдельных аминокислот регулировать обмен белка в скелетных мышцах. При этом очевидно, что анаболическая эффективность приема аминокислот может возрастать тогда, когда применяются определенные сочетания аминокислот в комплексе. В этом направлении нами разработан композиционный состав (патент РФ на изобретение № 2454227) для активации белкового анаболизма в скелетных мышцах, включающий аминокислоты Lряда: лейцин, изолейцин, метионин, аргинин.

Цель исследования – изучить влияние перорального применения оригинальной аминокислотной смеси на белковый, углеводный, липидный обмен в скелетных мышцах и печени экспериментальных животных.

Материалы и методы

Для приготовления смеси в качестве действующих компонентов использовали аминокислоты производства SigmaAldrich (США): Lаргинин (Кат. №A5006), Lметионин (Кат. №M9625), Lлейцин (Кат. №L8000), Lизолейцин (Кат. №I2752). Аминокислоты ex tempore смешивали в равных весовых соотношениях (1:1:1:1), растворяли при 37°С в дистиллированной воде из расчета 0,5 г смеси в 50 мл воды. Затем данным раствором пропитывали корм (хлеб из пшеничной муки высшего сорта), который перед раздачей высушивали при 37°С.

Экспериментальное исследование выполнено на 72 самцах мышей линии CBA в возрасте двух месяцев, весом 2530 г. Животные были разделены на две экспериментальные серии.

В первой серии (n=36) было выделено три группы. В группе 1 (n=12) мыши в течение двух месяцев получали сбалансированный по белку (3,3 г/сутки перевариваемого протеина) и углеводам рацион. Животные группы 2 (n=12) находились на углеводном, обедненным белком (0,88 г/сутки перевариваемого протеина) изокалорийном рационе, в котором источником белка служил пшеничный глиадин. Мыши группы 3 (n=12) находились на аналогичном животным второй группы рационе, в котором недостаток белка восполняли тестируемой смесью Lаминокислот (лейцин, изолейцин, аргинин, метионин в соотношении 1:1:1:1), в количестве, возмещающим недостаток аминного азота. Для питья все животные получали дистиллированную воду в свободном доступе.

Животным второй серии (n=36) моделировали острую печеночную недостаточность путем разового внутрибрюшинного введения 20% раствора четыреххлористого углерода (ЧХУ) на оливковом масле (патент РФ на изобретение № 2456927). Через 3е суток после инъекции ЧХУ все животные второй серии случайным методом были разделены на три группы в зависимости от рациона питания.

В первой группе данной серии животные (n=12) в течение двух месяцев получали обычный сбалансированный по белку (3,3 г/сутки перевариваемого протеина) и углеводам рацион. Животные второй группы (n=12) находились на углеводном, обедненным белком (0,88г/сутки перевариваемого протеина) изокалорийном рационе, в котором источником белка служил пшеничный глиадин. Мыши третьей группы (n=12) находились на аналогичном животным второй группы суточном рационе, в котором недостаток белка восполняли тестируемой смесью Lаминокислот (лейцин, изолейцин, аргинин, метионин в соотношении 1:1:1:1), в количестве, возмещающим недостаток аминного азота. Для питья все животные получали дистиллированную воду в свободном доступе.

6 животных из каждой группы были эвтаназированы через месяц после наала эксперимента, шесть – через 2 месяца. Эвтаназию проводили путем декапитации после наркотизирования диэтиловым эфиром.

На проведение исследования получено разрешение Комитета по Этике при ФГБУ «РНЦ «ВТО» им. Г.А. Илизарова». Исследование проведено при соблюдении принципов гуманного обращения с лабораторными животными в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей и Директивой А 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза от 22.09.2010 года по охране животных, используемых в научных целях.

После эвтаназии скелетные мышцы бедра очищали от соединительной ткани, печень препарировали. Уровень гликогена в навесках органов определяли: в мышцах – непрямым антроновым методом, в печени – прямым антроновым методом [14]. После экстракции хлороформ/метаноловой смесью (2:1) содержание общих липидов в печени и мышцах определяли гравиметрическим методом [14]. Отдельную навеску мышц отмывали от эритроцитов и растирали в 0,03М растворе КСl при 5°С до получения однородного гомогената. После 15 минут экстрагирования гомогенат центрифугировали 15 мин при 14000g на ультрацентрифуге «Beckman & Coulter» (США). В надосадке определяли содержание общего белка по методу Лоури. Забор крови проводили декапитацией, в сыворотке крови определяли концентрацию общего белка и мочевины наборами реагентов Vital Diagnostic (СПб) на биохимическом фотометре Stat Fax 1904+ (США).

Достоверность межгрупповых различий изученных показателей определяли с помощью непараметрического критерия КрускалаУоллиса с последующим множественным сравнением по критерию Данна. Данные на рисунках представлены в виде медианы, 25÷75го процентиля.

Результаты и их обсуждение

Оценка эффективности тестируемой аминокислотной смеси в части активации белкового анаболизма в скелетных мышцах была проведена параллельно с оценкой содержания гликогена и липидов в печени, т.к. известно, что печень значительно влияет на функциональное состояние скелетных мышц путем утилизации мышечного лактата, ресинтеза глюкозы и перераспределением пула экзогенных аминокислот [15].

Результаты эксперимента в первой серии животных показали, что в мышцах мышей 2й группы (с белковым ограничением) уровень гликогена статистически значимо возрастал (относительно мышей 1й и 3й групп) параллельно с увеличением длительности белкового ограничения в пище (рис. 1). На этом фоне у мышей данной группы отмечалась тенденция к снижению уровня общего белка в мышцах.

 

Рис. 1. Содержание гликогена, общих липидов и общего белка в мышцах мышей первой серии через 1 и 2 месяца эксперимента.

Примечание: цифрами над столбцами указаны номера групп, с которыми имелись статистически значимые (р<0,05) различия

 

У мышей 3й группы (с возмещением белковой недостаточности) относительно животных 2й группы был достоверно снижен уровень гликогена в мышцах через 1 и 2 месяца наблюдения. Уровень общих липидов в мышцах мышей 3й группы был значимо ниже значений как первой, так и второй группы. Отмечалась тенденция к повышению содержания общего белка в мышцах мышей 3й группы относительно 2й группы.

В печени мышей 2й группы через 1 и 2 месяца наблюдения отмечался значимый рост уровня гликогена (рис. 2). Содержание общих липидов в печени мышей 2й и 3й групп было статистически значимо снижено относительно значений 1й группы.

 

Рис. 2. Содержание гликогена и общих липидов в печени мышей первой серии через 1 и 2 месяца эксперимента.

Примечание: цифрами над столбцами указаны номера групп, с которыми имелись статистически значимые (р<0,05) различия

 

Таким образом, результаты первой серии эксперимента показали, что возмещение белковой недостаточности тестируемой аминокислотной смесью статистически значимо (относительно группы 2) предупреждало избыточный рост гликогена в мышцах, приводило к снижению липидов в ткани, а также предотвращало снижение уровня мышечного белка. При этом, на наш взгляд, очевидно и то, что прием тестируемой смеси оказывал регулирующее действие на метаболизм углеводов в печени, предупреждая повышенное их накопление, которое отмечалось на избыточной углеводной диете у животных 2й группы. Наблюдаемый широкий спектр воздействия исследуемых аминокислот на обмен основных веществ в мышцах и печени связан, повидимому, с тем, что в организме млекопитающих в условиях недостаточности белка данные аминокислоты могут играть роль системного регулятора (кофактора) как на ферментном, так и генетическом уровне, что согласуется с результатами ряда предшествующих работ [69].

На основании того факта, что печень регулирует распределение пула экзогенных аминокислот, нами была выполнена вторая серия экспериментов с моделированием острой печеночной недостаточности. По результатам данной серии обнаружено, что в группе 3 в отличие от группы 2 отмечалась тенденция к сохранению уровня белка в мышцах на уровне 1ой группы (рис. 3). Также отмечено, что через месяц эксперимента у мышей 3ей группы относительно 2ой группы зарегистрировано значимое увеличение содержание гликогена в мышцах и печени, а также уровень общих липидов в печени (рис. 4). Данный результат может быть связан с активирующим влиянием изучаемой аминокислотной смеси на глюконеогенез и липогенез в печени, что реализуется через непосредственное вовлечение в этот процесс продуктов дезаминирования потребляемых аминокислот – альфакетокислот. Эти процессы в конечном итоге способствовали сбережению запасов гликогена в печени у мышей группы 3.

Результаты второй серии эксперимента позволяют заключить, что прием тестируемой аминокислотной смеси, с одной стороны, способен проявлять прямой миотропный эффект и напрямую предупреждать потери белка в мышцах, с другой стороны, очевиден и гепатотропный эффект, направленный на возмещение азотистого недостатка в печени на фоне белкового ограничения. Такое действие тестируемой смеси способствовало поддержанию белковосинтетической функции печени, что подтверждалось данными исследования сыворотки крови. В частности, уровень общего белка в сыворотке крови животных 3й группы (возмещение белковой недостаточности) второй серии через 2 месяца эксперимента был достоверно повышен относительно животных 2й группы (белковая недостаточность) этой же серии (рис. 5). Не отмечено и значимого снижения синтеза мочевины.

 

Рис. 3. Содержание гликогена, общих липидов и общего белка в мышцах мышей второй серии через 1 и 2 месяца эксперимента.

Примечание: цифрами над столбцами указаны номера групп, с которыми имелись статистически значимые (р<0,05) различия

 

Рис. 4. Содержание гликогена и общих липидов в печени мышей второй серии через 1 и 2 месяца эксперимента.

Примечание: цифрами над столбцами указаны номера групп, с которыми имелись статистически значимые (р<0,05) различия

 

Рис. 5. Содержание общего белка и мочевины в сыворотке крови мышей второй серии через 1 и 2 месяца эксперимента.

Примечание: цифрами над столбцами указаны номера групп, с которыми имелись статистически значимые (р<0,05) различия

 

Заключение

Проведенное исследование показало, что тестируемая аминокислотная смесь (Lлейцин, Lизолейцин, Lаргинин, Lметионин в соотношении 1:1:1:1) при пероральном потреблении в течение 2х месяцев способна предупреждать нарушения белковоуглеводнолипидного соотношения в скелетных мышцах мышейсамцов линии CBA. Данный результат можно объяснить, как прямой активацией обмена в ткани, так и опосредованно – механизмами межорганного взаимодействия с печенью.

Таким образом, представленная аминокислотная смесь может быть в дальнейшем использована как потенциальный композиционный препарат, повышающий эффективность использования пищевого белка в целях активации анаболических процессов в скелетных мышцах животных и человека.

Об авторах

Максим Валерьевич Стогов

ФГБУ РНЦ Восстановительная травматология и ортопедия имени академика Г.А. Илизарова Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: stogo_off@list.ru
ORCID iD: 0000-0001-8516-8571
SPIN-код: 9345-8300

д.б.н., доцент, ведущий научный сотрудник лаборатории биохимии

Россия, 640005, г. Курган, ул. М. Ульяновой, д.6

Елена Анатольевна Киреева

ФГБУ РНЦ Восстановительная травматология и ортопедия имени академика Г.А. Илизарова Минздрава России

Email: stogo_off@list.ru
ORCID iD: 0000-0002-1006-5217
SPIN-код: 9598-0838

к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории биохимии

Россия, 640005, г. Курган, ул. М. Ульяновой, д.6

Список литературы

Дополнительные файлы