Изучение влияния прогестерона на активность Гликопротеина-P in vitro
- Авторы: Ерохина П.Д.1, Абаленихина Ю.В.1, Щулькин А.В.1, Черных И.В.1, Попова Н.М.1, Слепнев А.А.1, Якушева Е.Н.1
-
Учреждения:
- ФГБОУ ВО Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Минздрава России
- Выпуск: Том 28, № 2 (2020)
- Страницы: 135-142
- Раздел: Оригинальные исследования
- Статья получена: 01.07.2020
- Статья опубликована: 03.07.2020
- URL: https://journals.eco-vector.com/pavlovj/article/view/34901
- DOI: https://doi.org/10.23888/PAVLOVJ2020282135-142
- ID: 34901
Цитировать
Аннотация
Актуальность. Гликопротеин-Р (Pgp, АВСВ1) – белок-транспортер, участвующий в фармакокинетике лекарственных веществ, а также развитии резистентности опухолевых клеток к химиотерапии.
Цель. Изучить влияние прогестерона на активность Pgp in vitro на клеточной модели эпителия тонкого кишечника человека.
Материалы и методы. Исследования выполнены на линии клеток Caco-2. Активность Pgp оценивали по транспорту фексофенадина в специальной трансвелл-системе. Концентрацию фексофенадина анализировали методом ВЭЖХ. Количество Pgp определяли методом ИФА. Были выполнены четыре серии экспериментов: контроль – клетки, которые преинкубировали с чистой транспортной средой без добавления каких-либо веществ; влияние рифампицина на активность и синтез Pgp в концентрации 10 мкмоль/л при преинкубировании в течение 3 сут (контроль индукции); влияние прогестерона на активность Pgp в концентрациях 1, 10 и 100 мкмоль/л при преинкубировании в течение 30 мин; влияние прогестерона на активность и синтез Pgp в концентрациях 1, 10 и 100 мкмоль/л при преинкубировании в течение 3 сут.
Результаты. Прогестерон в концентрациях 1 и 10 мкМ при инкубации с клетками в течение 30 мин достоверно не влиял на активность Pgp, однако в концентрации 100 мкМ снижал активность белка-транспортера.
При инкубировании клеток линии Caco-2 с прогестероном в концентрациях 1, 10 и 100 мкМ в течение 3 сут активность Pgp не изменялась. Прогестерон в концентрации 100 мкМ при инкубировании в течение 3 сут значимо повышал синтез Pgp в энтероцитах на 114,3% по сравнению с показателями контроля, а в остальных используемых концентрациях (1 и 10 мкМ) достоверного эффекта не оказал.
Заключение. Прогестерон в эксперименте in vitro на клетках линии Caco-2 в концентрации 100 мкМ оказывает прямое ингибирующее действие на активность Pgp, однако при инкубации в течение 3 сут повышает синтез белка-транспортера, что нивелирует его ингибирующую активность.
Ключевые слова
Полный текст
Гликопротеин-Р (Pgp, ABCB1) – белок-транспортер, экспрессирующийся в билипидной мембране клеток. Pgp обеспечивает защиту органов и тканей от ксенобиотиков, являющихся его субстратами, выводя их из клеток во внеклеточное пространство и биологические жидкости. Например, экспрессируясь в опухолевых клетках он формирует развитие их резистентности к химиотерапии, в энтероцитах кишечника препятствует всасыванию веществ, в гепатоцитах и эпителии почечных канальцев выводит вещества в желчь и мочу соответственно, в эндотелиальных клетках гистогематических барьеров препятствует проникновению веществ в забарьерные органы [1].
Показано, что некоторые вещества способны влиять на функционирование Pgp. Индукторы (рифампицин) повышают активность белка-транспортера, а ингибиторы (верапамил, хинидин) ее снижают [2].
Установлено регулирующее влияние половых гормонов на функционирование Pgp [3, 4]. При изучении действия прогестерона на активность и синтез Pgp были получены противоречивые результаты.
На клеточной линии карциномы яичника человека (NCI-ADR-RES), содержащей значительное количество рецепторов к прогестерону, установлено, что экспрессия гена MDR1, увеличивалась после 8 ч инкубации с прогестероном в концентрации 10-7 М. Влияние прогестерона на клеточную линию карциномы плаценты человека (JAR) с низким уровнем прогестероновых рецепторов не привело к повышению экспрессии гена MDR1. При этом использование прогестерона в течение 24 и 72 ч дозозависимо (в концентрациях более 10-8 М) увеличивало экспрессию белка Pgp в клетках линии NCI-ADR-RES и JAR. Повышение экспрессии транспортера сопровождалась увеличением его активности, которую оценивали по накоплению клетками субстратов Pgp – саквинавира и паклитаксела [5].
На линии клеток L-MDR1, образованной трансфекцией линии эпителиоцитов почки свиньи LLC-PK1 геном MDR1 человека, и доксорубицинорезистентной клеточной линии моноцитарной лейкемии мышей с повышенной экспрессией mdr1a/1b (P388/dx) выявлено, что прогестерон сни-жал активность Pgp в концентрации 13,3±3,2 мкМ на линии клеток L-MDR1 и в концентрации 30,2±9,8 мкМ – на клеточной линии P388/dx [6].
Анализ литературы показал, что исследований на линиях клеток основных органов, отвечающих за фармакокинетику лекарственных веществ (кишечном и почечном эпителии, гепатоцитах, эндотелии гистогематических барьеров), практически не проводилось.
Ранее нами в экспериментах in vivo на кроликах было показано, что прогестерон повышает активность и синтез Pgp в энтероцитах кишечника [4].
Целью настоящего исследования явилось изучение влияние прогестерона на активность Pgp in vitro на клеточной модели эпителия тонкого кишечника человека.
Материалы и методы
Исследования in vitro выполнены на линии клеток карциномы ободочной кишки человека - Caco-2, полученной из ФГБУН ИНЦ РАН, Санкт-Петербург.
Клеточную линию Caco-2 культивировали при 37ºС и 5% концентрацией СО2 в Дульбекко модифицированной среде Игла (DMEM), содержащей глюкозу (4500 мг/л) («Sigma-Aldrich», Германия), L-глутамин (4 мМ) («Sigma-Aldrich», Германия), 15% бычьей сыворотки («Sigma-Aldrich», Германия), 100 ЕД/мл пенициллина («Sigma-Aldrich», Германия) и 100 мкг/мл стрептомицина. При достижении 70-90% конфлюентности клетки снимали с фласка за счет добавления раствора трипсин-ЭДТА (0,25% трипсина и 0,2% ЭДТА, «Sigma-Aldrich», Германия) и высеивали в трансвелл-систему для оценки активности Pgp или в 6 луночные планшеты для определения влияния прогестерона на синтез белка-транспортера. Клетки культивировали в течение 21 сут, когда происходит их спонтанная дифференцировка в клетки, подобные кишечному эпителию [7].
Трансвелл-система представлена апикальной (a) и базолатеральной (b) камерами. Дном апикальной камеры является полупроницаемая мембрана, на которую высеивали клетки с плотностью 105/см2 (33 000 клеток/ячейка). В исследовании применяли 12-луночный планшет с полупроницаемой мембраной (12 mm Transwell® with 0.4 µm Pore Polycarbonate Membrane Insert, Sterile, Corning, США). При достижении трансэпителиального сопротивления выше 500 мОм*см2 выполняли транспортные эксперименты. Интервал между транспортными экспериментами в одной и той же трансвелл-системе составлял не менее 7 дней.
Функционирование Pgp оценивали по транспорту его маркерного субстрата – фексофенадина («Sigma-Aldrich», Германия) в трансвелл-системе. Для этого питательную среду заменяли на транспортную - раствор Хэнкса («Sigma-Aldrich», Германия), забуференный 25 мМ Хепес при рН 7,4 («Sigma-Aldrich», Германия) с содержанием 1% диметилсульфоксида («ПанЭко», Россия). Далее в апикальную камеру добавляли фексофенадин в конечной концентрации 150 мкМ [7], а через 1, 2 и 3 ч осуществляли забор образцов транспортной среды (50 мкл) из базолатеральной камеры для определения содержания маркерного субстрата (a-b транспорт, за счет пассивной диффузии против функционирования Pgp).
Затем в других трансвелл-системах оценивали транспорт фексофенадина из базолатеральной камеры в апикальную (b-a транспорт за счет пассивной диффузии и белка-транспортера). Для этого фексофенадин в концентрации 150 мкМ добавляли в базолатеральную камеру, а через 1, 2 и 3 ч забирали образцы транспортной среды (50 мкл) из апикальной камеры для определения концентрации маркерного субстрата.
Транспорт фексофенадина из камеры a в камеру b и обратно оценивали по формуле [8]:
где Рарр – коэффициент кажущейся проницаемости (apparent permeability coefficient), dQ/dt – изменение концентрации субстрата в камере реципиенте за время инкубации, A – площадь полупроницаемой мембраны лунки в трансвелл-системе, на которой культивировали клетки, C0– начальная концентрация субстрата в камере-доноре.
Далее определяли отношение коэффициентов кажущейся проницаемости: ba к ab.
Данный параметр, являясь интегральным, показывает общий вклад белка-транспортера Pgp в перенос маркерного субстрата фексофенадина через билипидную мембрану.
Содержание фексофенадина в транспортной среде определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ детектированием на хроматографе «Стайер» (Россия) по разработанной нами методике [2]. Полученную пробу транспортной среды (50 мкл), содержащую фексофенадин, разводили в 150 мкл подвижной фазы, и 100 мкл полученного раствора вводили в хроматограф.
Для оценки влияния прогестерона на активность Pgp in vitro его добавляли в обе камеры (апикальную и базолатеральную) вне зависимости от направления транспорта фексофенадина.
Для изучения влияния прогестерона на синтез Pgp клетки снимали с лунок 6 луночного планшета добавлением раствора трипсин-ЭДТА (0,25% трипсина и 0,2% ЭДТА, «Sigma-Aldrich», Германия). Полученные клетки лизировали трехкратным циклом замораживания-размораживания. В полученном лизате определяли содержание Pgp методом ИФА с помощью набора Human Permeability glycoprotein ELISA kit («Blue gene», Китай). Количество белка в пробах анализировали методом Бредфорда (Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit, «ThermoFisher», США).
В ходе исследования были выполнены следующие серии экспериментов:
1) Контроль – клетки, которые преинкубировали с чистой транспортной средой без добавления каких-либо веществ;
2) Влияние рифампицина на активность и синтез Pgp в концентрации 10 мкмоль/л при преинкубировании в течение 3 сут – контроль индукции;
3) Влияние прогестерона на активность Pgp в концентрациях 1, 10 и 100 мкмоль/л при преинкубировании в течение 30 мин;
4) Влияние прогестерона на активность и синтез Pgp в концентрациях 1, 10 и 100 мкмоль/л при преинкубировании в течение 3 сут.
Полученные результаты обрабатывали с применением программы «Stat Soft Statistica 13.0» (США, лицензия JPZ811I52 1319AR25ACD-W) и Microsoft Excel for MAC ver. 16.24 (ID02984-001-000001). Для оценки статистической значимости различий использовали дисперсионный анализ (ANOVA), попарные сравнения выполняли с помощью критерия Ньюмена-Кейлса. Статистически значимыми считали различия при p<0,05.
Результаты и их обсуждение
Результаты эксперимента представлены в таблице 1 и на рисунке 1.
Культивирование клеток линии Caco-2 c 10 мкМ рифампицина в течение 3 сут приводило к повышению активности Pgp, что проявлялось в снижении Papp ab на 31,7% (p<0,05) и повышении отношения Papp ba к Papp ab на 93,2% (p<0,05).
Прогестерон в концентрациях 1 и 10 мкМ при инкубации с клетками Caco-2 в течение 30 мин достоверно не влиял на активность Pgp. В то же время в концентрации 100 мкМ снижал отношение Papp ba к Papp ab на 26,2% (p<0,05), что свидетельствует о снижении активности белка-транспортера.
При инкубировании клеток линии Caco-2 с прогестероном в течение 3 сут в концентрациях 1, 10 и 100 мкМ изучаемые показатели Papp ba, Papp ab и их отношение достоверно не изменялись по сравнению со значениями контроля.
В следующей серии экспериментов было изучено влияние прогестерона и рифампицина на синтез белка-транспортера Pgp в клетках линии Caco-2.
Рифампицин в концентрации 10 мкМ при инкубировании в течение 3 сут вызывал повышение количества Pgp в энтероцитах на 52,7% (p<0,05), что подтверждает корректность эксперимента, т.к. рифампицин является классическим индуктором белка-транспортера, повышающим его активность за счет увеличения синтеза [2].
Прогестерон в концентрации 100 мкМ при инкубации в течение 3 сут повышал синтез Pgp в энтероцитах на 114,3% (p=0,018) по сравнению с показателями контроля, а в остальных концентрациях (1 и 10 мкМ) достоверного эффекта не оказал (рис. 1).
Таблица 1 Влияние прогестерона на транспорт фексофенадина через билипидную мембрану клеток линии Caco-2 (M±SD, x10-6 см/сек)
| Papp ba | Papp ab | Papp ba/ Papp ab |
Контроль, n=5 | 2,32±0,66 | 0,82±0,15 | 2,79±0,36 |
Рифампицин 10 мкМ 3 сут, n=3 | 2,9±0,31 | 0,56±0,09* | 5,39±1,24* |
Прогестерон 1 мкМ 30 мин, n=3 | 1,96±0,18 | 0,72±0,17 | 2,83±0,76 |
Прогестерон 10 мкМ 30 мин, n=3 | 2,4±0,24 | 0,89±0,25 | 2,93±1,23 |
Прогестерон 100 мкМ 30 мин, n=3 | 2,03±0,42 | 0,99±0,19 | 2,06±0,17* |
Прогестерон 1 мкМ 3 сут, n=3 | 1,95±0,46 | 0,63±0,31 | 3,36±0,83 |
Прогестерон 10 мкМ 3 сут, n=3 | 2,13±0,18 | 0,71±0,15 | 3,1±0,71 |
Прогестерон 100 мкМ 3 сут, n=3 | 2,32±0,42 | 0,76±0,66 | 3,1±0,84 |
Примечание: * p<0,05 – статистически значимые различия по сравнению с показателями контроля
Рис 1. Количество Pgp в клетках линии Caco-2 при воздействии прогестерона (M±SD, нг/мг белка)
Примечания: 1 – контроль (n=7), 2 – рифампицин 10 мкМ 3 сут (n=4), 3 – прогестерон 1 мкМ 3 сут (n=3), 4 – прогестерон 10 мкМ 3 сут (n=3), 5 – прогестерон 100 мкМ 3 сут (n=3)
Полученные результаты показывают, что прогестерон является прямым ингибитором Pgp, то есть способен подавлять его активность при непосредственном взаимодействии с его молекулой, что было установлено в опытах при инкубировании гормона в концентрации 100 мкМ с клетками Caco-2 в течение 30 мин.
В тоже время, прогестерон при длительной инкубации (3 сут) повышает синтез белка-транспортера в культуре клеток. При этом активность Pgp достоверно от показателей контроля не отличается, что видимо связано с прямым ингибированием гормоном молекулы Pgp, которое, по-видимому, компенсаторно активирует синтез транспортера.
Прямое ингибирующее действие прогестерона на активность Pgp и при этом его способность повышать синтез белка-транспортера вероятно лежат в основе противоречивых результатов, описанных в литературе.
Механизмы повышения синтеза Pgp под действием прогестерона могут быть связаны с влиянием на экспрессию гена MDR1, кодирующего белок-транспортер, при взаимодействии со специфическими прогестероновыми рецепторами, или с транскрипционными факторами, например, прегнан-Х-рецептором (PXR) или конститутивным андростановым рецептором (CAR) [5, 9].
Прогестероновые рецепторы в линии клеток Caco-2 не описаны, хотя их экспрессия обнаружена в кишечнике человека [10].
Таким образом, механизм активации синтеза Pgp под влиянием прогестерона требует дальнейшего изучения и уточнения.
Заключение
Прогестерон в эксперименте in vitro на клетках линии Caco-2 в концентрации 100 мкМ оказывает прямое ингибирующее действие на активность Pgp, однако при инкубировании в течение 3 сут повышает синтез белка-транспортера, что нивелирует его ингибирующую активность. Видимо, прямое ингибирующее действие прогестерона на активность Pgp в энтероцитах сопровождается компенсаторной активацией его синтеза.
Об авторах
Пелагея Дмитриевна Ерохина
ФГБОУ ВО Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Минздрава России
Email: p34-66@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-4802-5656
студент
Россия, РязаньЮлия Владимировна Абаленихина
ФГБОУ ВО Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Минздрава России
Email: p34-66@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-0427-0967
SPIN-код: 4496-9027
ResearcherId: L-8965-2018
к.б.н., доцент кафедры биологической химии с курсом КЛД ФДПО
Россия, РязаньАлексей Владимирович Щулькин
ФГБОУ ВО Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Минздрава России
Email: p34-66@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1688-0017
SPIN-код: 2754-1702
ResearcherId: N-9143-2016
к.м.н., доцент кафедры фармакологии с курсом фармации ФДПО
Россия, РязаньИван Владимирович Черных
ФГБОУ ВО Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Минздрава России
Email: p34-66@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5618-7607
SPIN-код: 5238-6165
ResearcherId: R-1389-2017
к.б.н., доцент кафедры биологической химии с курсом КЛД ФДПО
Россия, РязаньНаталья Михайловна Попова
ФГБОУ ВО Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Минздрава России
Автор, ответственный за переписку.
Email: p34-66@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5166-8372
SPIN-код: 7553-9852
ResearcherId: B-1130-2016
к.м.н., доцент кафедры фармакологии с курсом фармации ФДПО
Россия, РязаньАлександр Александрович Слепнев
ФГБОУ ВО Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Минздрава России
Email: p34-66@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-0696-6554
к.б.н., доцент кафедры фармакологии с курсом фармации ФДПО
Россия, РязаньЕлена Николаевна Якушева
ФГБОУ ВО Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Минздрава России
Email: p34-66@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-6887-4888
SPIN-код: 2865-3080
ResearcherId: T-6343-2017
д.м.н., профессор, зав. кафедрой фармакологии с курсом фармации ФДПО
Россия, РязаньСписок литературы
- Якушева Е.Н., Щулькин А.В., Попова Н.М., и др. Структура, функции гликопротеина-Р и его значение для рациональной фармакотерапии // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. 2014. №2. С. 3-11.
- Якушева Е.Н., Черных И.В., Щулькин А.В., и др. Методика определения принадлежности лекарственных средств к числу субстратов гликопротеина-P // Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. 2015. №3. С. 49-53.
- Гацанога М.В., Черных И.В., Щулькин А.В., и др. Можно ли оценивать принадлежность лекарственных веществ к субстратам гликопротеина-P на самках кроликов породы шиншилла // Наука молодых (Eruditio Juvenium). 2016. №3. С. 5-10.
- Щулькин А.В, Черных И.В., Якушева Е.Н., и др. Влияние прогестерона на функциональную активность гликопротеина-Р в эксперименте // Химико-фармацевтический журнал. 2018. Т. 52, №7. С. 3-8. doi: 10.30906/0023-1134-2018-52-7-3-8
- Coles L.D., Lee I.J., Voulalas P.J., et al. Estradiol and progesterone-mediated regulation of P-gp in P-gp overexpressing cells (NCI-ADR-RES) and placental cells (JAR) // Molecular Pharmaceutics. 2009. Vol. 6, №6. P. 1816-1825. doi: 10.1021/mp900077q
- Fröhlich M., Albermann N., Sauer A., et al. In vitro and ex vivo evidence for modulation of P-glycoprotein activity by progestins // Biochemical Pharmacology. 2004. Vol. 68, №12. P. 2409-2416. doi:10. 1016/j.bcp.2004.08.026
- Petri N., Tannergren C., Rungstad D., et al. Transport characteristics of fexofenadine in the Caco-2 cell model // Pharmaceutical Research. 2004. Vol. 21, №8. P. 1398-1404. doi:10.1023/ b:pham.0000036913.90332.b1
- Elsby R., Surry D.D., Smith V.N., et al. Validation and application of Caco-2 assays for the in vitro evaluation of development candidate drugs as substrates or inhibitors of P-glycoprotein to support regulatory submissions // Xenobiotica. 2008. Vol. 38(7-8). P. 1140-1164. doi: 10.1080/00498250802050880
- Kliewer S.A., Moore J.T., Wade L. An orphan nuclear receptor activated by pregnanes defines a novel steroid signaling pathway // Cell. 1998. Vol. 92, №1. P. 73-82. doi: 10.1016/s0092-8674(00)80900-9
- Watanabe K., Jinriki T., Sato J. Effects of progesterone and norethisterone on cephalexin transport and peptide transporter PEPT1 expression in human intestinal cell line Caco-2 // Biological & Pharmaceutical Bulletin. 2006. Vol. 29, №1. P. 90-95. doi: 10.1248/bpb.29.90
Дополнительные файлы
