Изучение влияния прогестерона на активность Гликопротеина-P in vitro

Обложка


Цитировать

Аннотация

Актуальность. Гликопротеин-Р (Pgp, АВСВ1) – белок-транспортер, участвующий в фармакокинетике лекарственных веществ, а также развитии резистентности опухолевых клеток к химиотерапии.

Цель. Изучить влияние прогестерона на активность Pgp in vitro на клеточной модели эпителия тонкого кишечника человека.

Материалы и методы. Исследования выполнены на линии клеток Caco-2. Активность Pgp оценивали по транспорту фексофенадина в специальной трансвелл-системе. Концентрацию фексофенадина анализировали методом ВЭЖХ. Количество Pgp определяли методом ИФА. Были выполнены четыре серии экспериментов: контроль – клетки, которые преинкубировали с чистой транспортной средой без добавления каких-либо веществ; влияние рифампицина на активность и синтез Pgp в концентрации 10 мкмоль/л при преинкубировании в течение 3 сут (контроль индукции); влияние прогестерона на активность Pgp в концентрациях 1, 10 и 100 мкмоль/л при преинкубировании в течение 30 мин; влияние прогестерона на активность и синтез Pgp в концентрациях 1, 10 и 100 мкмоль/л при преинкубировании в течение 3 сут.

Результаты. Прогестерон в концентрациях 1 и 10 мкМ при инкубации с клетками в течение 30 мин достоверно не влиял на активность Pgp, однако в концентрации 100 мкМ снижал активность белка-транспортера.

При инкубировании клеток линии Caco-2 с прогестероном в концентрациях 1, 10 и 100 мкМ в течение 3 сут активность Pgp не изменялась. Прогестерон в концентрации 100 мкМ при инкубировании в течение 3 сут значимо повышал синтез Pgp в энтероцитах на 114,3% по сравнению с показателями контроля, а в остальных используемых концентрациях (1 и 10 мкМ) достоверного эффекта не оказал.

Заключение. Прогестерон в эксперименте in vitro на клетках линии Caco-2 в концентрации 100 мкМ оказывает прямое ингибирующее действие на активность Pgp, однако при инкубации в течение 3 сут повышает синтез белка-транспортера, что нивелирует его ингибирующую активность.

Полный текст

Гликопротеин-Р (Pgp, ABCB1) – белок-транспортер, экспрессирующийся в билипидной мембране клеток. Pgp обеспечивает защиту органов и тканей от ксенобиотиков, являющихся его субстратами, выводя их из клеток во внеклеточное пространство и биологические жидкости. Например, экспрессируясь в опухолевых клетках он формирует развитие их резистентности к химиотерапии, в энтероцитах кишечника препятствует всасыванию веществ, в гепатоцитах и эпителии почечных канальцев выводит вещества в желчь и мочу соответственно, в эндотелиальных клетках гистогематических барьеров препятствует проникновению веществ в забарьерные органы [1].

Показано, что некоторые вещества способны влиять на функционирование Pgp. Индукторы (рифампицин) повышают активность белка-транспортера, а ингибиторы (верапамил, хинидин) ее снижают [2].

Установлено регулирующее влияние половых гормонов на функционирование Pgp [3, 4]. При изучении действия прогестерона на активность и синтез Pgp были получены противоречивые результаты.

На клеточной линии карциномы яичника человека (NCI-ADR-RES), содержащей значительное количество рецепторов к прогестерону, установлено, что экспрессия гена MDR1, увеличивалась после 8 ч инкубации с прогестероном в концентрации 10-7 М. Влияние прогестерона на клеточную линию карциномы плаценты человека (JAR) с низким уровнем прогестероновых рецепторов не привело к повышению экспрессии гена MDR1. При этом использование прогестерона в течение 24 и 72 ч дозозависимо (в концентрациях более 10-8 М) увеличивало экспрессию белка Pgp в клетках линии NCI-ADR-RES и JAR. Повышение экспрессии транспортера сопровождалась увеличением его активности, которую оценивали по накоплению клетками субстратов Pgp – саквинавира и паклитаксела [5].

На линии клеток L-MDR1, образованной трансфекцией линии эпителиоцитов почки свиньи LLC-PK1 геном MDR1 человека, и доксорубицинорезистентной клеточной линии моноцитарной лейкемии мышей с повышенной экспрессией mdr1a/1b (P388/dx) выявлено, что прогестерон сни-жал активность Pgp в концентрации 13,3±3,2 мкМ на линии клеток L-MDR1 и в концентрации 30,2±9,8 мкМ – на клеточной линии P388/dx [6].

Анализ литературы показал, что исследований на линиях клеток основных органов, отвечающих за фармакокинетику лекарственных веществ (кишечном и почечном эпителии, гепатоцитах, эндотелии гистогематических барьеров), практически не проводилось.

Ранее нами в экспериментах in vivo на кроликах было показано, что прогестерон повышает активность и синтез Pgp в энтероцитах кишечника [4].

Целью настоящего исследования явилось изучение влияние прогестерона на активность Pgp in vitro на клеточной модели эпителия тонкого кишечника человека.

Материалы и методы

Исследования in vitro выполнены на линии клеток карциномы ободочной кишки человека - Caco-2, полученной из ФГБУН ИНЦ РАН, Санкт-Петербург.

Клеточную линию Caco-2 культивировали при 37ºС и 5% концентрацией СО2 в Дульбекко модифицированной среде Игла (DMEM), содержащей глюкозу (4500 мг/л) («Sigma-Aldrich», Германия), L-глутамин (4 мМ) («Sigma-Aldrich», Германия), 15% бычьей сыворотки («Sigma-Aldrich», Германия), 100 ЕД/мл пенициллина («Sigma-Aldrich», Германия) и 100 мкг/мл стрептомицина. При достижении 70-90% конфлюентности клетки снимали с фласка за счет добавления раствора трипсин-ЭДТА (0,25% трипсина и 0,2% ЭДТА, «Sigma-Aldrich», Германия) и высеивали в трансвелл-систему для оценки активности Pgp или в 6 луночные планшеты для определения влияния прогестерона на синтез белка-транспортера. Клетки культивировали в течение 21 сут, когда происходит их спонтанная дифференцировка в клетки, подобные кишечному эпителию [7].

Трансвелл-система представлена апикальной (a) и базолатеральной (b) камерами. Дном апикальной камеры является полупроницаемая мембрана, на которую высеивали клетки с плотностью 105/см2 (33 000 клеток/ячейка). В исследовании применяли 12-луночный планшет с полупроницаемой мембраной (12 mm Transwell® with 0.4 µm Pore Polycarbonate Membrane Insert, Sterile, Corning, США). При достижении трансэпителиального сопротивления выше 500 мОм*см2 выполняли транспортные эксперименты. Интервал между транспортными экспериментами в одной и той же трансвелл-системе составлял не менее 7 дней.

Функционирование Pgp оценивали по транспорту его маркерного субстрата – фексофенадина («Sigma-Aldrich», Германия) в трансвелл-системе. Для этого питательную среду заменяли на транспортную - раствор Хэнкса («Sigma-Aldrich», Германия), забуференный 25 мМ Хепес при рН 7,4 («Sigma-Aldrich», Германия) с содержанием 1% диметилсульфоксида («ПанЭко», Россия). Далее в апикальную камеру добавляли фексофенадин в конечной концентрации 150 мкМ [7], а через 1, 2 и 3 ч осуществляли забор образцов транспортной среды (50 мкл) из базолатеральной камеры для определения содержания маркерного субстрата (a-b транспорт, за счет пассивной диффузии против функционирования Pgp).

Затем в других трансвелл-системах оценивали транспорт фексофенадина из базолатеральной камеры в апикальную (b-a транспорт за счет пассивной диффузии и белка-транспортера). Для этого фексофенадин в концентрации 150 мкМ добавляли в базолатеральную камеру, а через 1, 2 и 3 ч забирали образцы транспортной среды (50 мкл) из апикальной камеры для определения концентрации маркерного субстрата.

Транспорт фексофенадина из камеры a в камеру b и обратно оценивали по формуле [8]:

Papp=dQdt×1(A×C0)

где Рарр – коэффициент кажущейся проницаемости (apparent permeability coefficient), dQ/dt – изменение концентрации субстрата в камере реципиенте за время инкубации, A – площадь полупроницаемой мембраны лунки в трансвелл-системе, на которой культивировали клетки, C0– начальная концентрация субстрата в камере-доноре.

Далее определяли отношение коэффициентов кажущейся проницаемости: ba к ab.

Данный параметр, являясь интегральным, показывает общий вклад белка-транспортера Pgp в перенос маркерного субстрата фексофенадина через билипидную мембрану.

Содержание фексофенадина в транспортной среде определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ детектированием на хроматографе «Стайер» (Россия) по разработанной нами методике [2]. Полученную пробу транспортной среды (50 мкл), содержащую фексофенадин, разводили в 150 мкл подвижной фазы, и 100 мкл полученного раствора вводили в хроматограф.

Для оценки влияния прогестерона на активность Pgp in vitro его добавляли в обе камеры (апикальную и базолатеральную) вне зависимости от направления транспорта фексофенадина.

Для изучения влияния прогестерона на синтез Pgp клетки снимали с лунок 6 луночного планшета добавлением раствора трипсин-ЭДТА (0,25% трипсина и 0,2% ЭДТА, «Sigma-Aldrich», Германия). Полученные клетки лизировали трехкратным циклом замораживания-размораживания. В полученном лизате определяли содержание Pgp методом ИФА с помощью набора Human Permeability glycoprotein ELISA kit («Blue gene», Китай). Количество белка в пробах анализировали методом Бредфорда (Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit, «ThermoFisher», США).

В ходе исследования были выполнены следующие серии экспериментов:

1) Контроль – клетки, которые преинкубировали с чистой транспортной средой без добавления каких-либо веществ;

2) Влияние рифампицина на активность и синтез Pgp в концентрации 10 мкмоль/л при преинкубировании в течение 3 сут – контроль индукции;

3) Влияние прогестерона на активность Pgp в концентрациях 1, 10 и 100 мкмоль/л при преинкубировании в течение 30 мин;

4) Влияние прогестерона на активность и синтез Pgp в концентрациях 1, 10 и 100 мкмоль/л при преинкубировании в течение 3 сут.

Полученные результаты обрабатывали с применением программы «Stat Soft Statistica 13.0» (США, лицензия JPZ811I52 1319AR25ACD-W) и Microsoft Excel for MAC ver. 16.24 (ID02984-001-000001). Для оценки статистической значимости различий использовали дисперсионный анализ (ANOVA), попарные сравнения выполняли с помощью критерия Ньюмена-Кейлса. Статистически значимыми считали различия при p<0,05.

Результаты и их обсуждение

Результаты эксперимента представлены в таблице 1 и на рисунке 1.

Культивирование клеток линии Caco-2 c 10 мкМ рифампицина в течение 3 сут приводило к повышению активности Pgp, что проявлялось в снижении Papp ab на 31,7% (p<0,05) и повышении отношения Papp ba к Papp ab на 93,2% (p<0,05).

Прогестерон в концентрациях 1 и 10 мкМ при инкубации с клетками Caco-2 в течение 30 мин достоверно не влиял на активность Pgp. В то же время в концентрации 100 мкМ снижал отношение Papp ba к Papp ab на 26,2% (p<0,05), что свидетельствует о снижении активности белка-транспортера.

При инкубировании клеток линии Caco-2 с прогестероном в течение 3 сут в концентрациях 1, 10 и 100 мкМ изучаемые показатели Papp ba, Papp ab и их отношение достоверно не изменялись по сравнению со значениями контроля.

В следующей серии экспериментов было изучено влияние прогестерона и рифампицина на синтез белка-транспортера Pgp в клетках линии Caco-2.

Рифампицин в концентрации 10 мкМ при инкубировании в течение 3 сут вызывал повышение количества Pgp в энтероцитах на 52,7% (p<0,05), что подтверждает корректность эксперимента, т.к. рифампицин является классическим индуктором белка-транспортера, повышающим его активность за счет увеличения синтеза [2].

Прогестерон в концентрации 100 мкМ при инкубации в течение 3 сут повышал синтез Pgp в энтероцитах на 114,3% (p=0,018) по сравнению с показателями контроля, а в остальных концентрациях (1 и 10 мкМ) достоверного эффекта не оказал (рис. 1).

 

Таблица 1 Влияние прогестерона на транспорт фексофенадина через билипидную мембрану клеток линии Caco-2 (M±SD, x10-6 см/сек)

 

Papp ba

Papp ab

Papp ba/ Papp ab

Контроль, n=5

2,32±0,66

0,82±0,15

2,79±0,36

Рифампицин 10 мкМ 3 сут, n=3

2,9±0,31

0,56±0,09*

5,39±1,24*

Прогестерон 1 мкМ 30 мин, n=3

1,96±0,18

0,72±0,17

2,83±0,76

Прогестерон 10 мкМ 30 мин, n=3

2,4±0,24

0,89±0,25

2,93±1,23

Прогестерон 100 мкМ 30 мин, n=3

2,03±0,42

0,99±0,19

2,06±0,17*

Прогестерон 1 мкМ 3 сут, n=3

1,95±0,46

0,63±0,31

3,36±0,83

Прогестерон 10 мкМ 3 сут, n=3

2,13±0,18

0,71±0,15

3,1±0,71

Прогестерон 100 мкМ 3 сут, n=3

2,32±0,42

0,76±0,66

3,1±0,84

Примечание: * p<0,05 – статистически значимые различия по сравнению с показателями контроля

 

Рис 1. Количество Pgp в клетках линии Caco-2 при воздействии прогестерона (M±SD, нг/мг белка)

Примечания: 1 – контроль (n=7), 2 – рифампицин 10 мкМ 3 сут (n=4), 3 – прогестерон 1 мкМ 3 сут (n=3), 4 – прогестерон 10 мкМ 3 сут (n=3), 5 – прогестерон 100 мкМ 3 сут (n=3)

 

Полученные результаты показывают, что прогестерон является прямым ингибитором Pgp, то есть способен подавлять его активность при непосредственном взаимодействии с его молекулой, что было установлено в опытах при инкубировании гормона в концентрации 100 мкМ с клетками Caco-2 в течение 30 мин.

В тоже время, прогестерон при длительной инкубации (3 сут) повышает синтез белка-транспортера в культуре клеток. При этом активность Pgp достоверно от показателей контроля не отличается, что видимо связано с прямым ингибированием гормоном молекулы Pgp, которое, по-видимому, компенсаторно активирует синтез транспортера.

Прямое ингибирующее действие прогестерона на активность Pgp и при этом его способность повышать синтез белка-транспортера вероятно лежат в основе противоречивых результатов, описанных в литературе.

Механизмы повышения синтеза Pgp под действием прогестерона могут быть связаны с влиянием на экспрессию гена MDR1, кодирующего белок-транспортер, при взаимодействии со специфическими прогестероновыми рецепторами, или с транскрипционными факторами, например, прегнан-Х-рецептором (PXR) или конститутивным андростановым рецептором (CAR) [5, 9].

Прогестероновые рецепторы в линии клеток Caco-2 не описаны, хотя их экспрессия обнаружена в кишечнике человека [10].

Таким образом, механизм активации синтеза Pgp под влиянием прогестерона требует дальнейшего изучения и уточнения.

Заключение

Прогестерон в эксперименте in vitro на клетках линии Caco-2 в концентрации 100 мкМ оказывает прямое ингибирующее действие на активность Pgp, однако при инкубировании в течение 3 сут повышает синтез белка-транспортера, что нивелирует его ингибирующую активность. Видимо, прямое ингибирующее действие прогестерона на активность Pgp в энтероцитах сопровождается компенсаторной активацией его синтеза.

×

Об авторах

Пелагея Дмитриевна Ерохина

ФГБОУ ВО Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Минздрава России

Email: p34-66@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-4802-5656

студент

Россия, Рязань

Юлия Владимировна Абаленихина

ФГБОУ ВО Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Минздрава России

Email: p34-66@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-0427-0967
SPIN-код: 4496-9027
ResearcherId: L-8965-2018

к.б.н., доцент кафедры биологической химии с курсом КЛД ФДПО

Россия, Рязань

Алексей Владимирович Щулькин

ФГБОУ ВО Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Минздрава России

Email: p34-66@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1688-0017
SPIN-код: 2754-1702
ResearcherId: N-9143-2016

к.м.н., доцент кафедры фармакологии с курсом фармации ФДПО

Россия, Рязань

Иван Владимирович Черных

ФГБОУ ВО Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Минздрава России

Email: p34-66@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5618-7607
SPIN-код: 5238-6165
ResearcherId: R-1389-2017

к.б.н., доцент кафедры биологической химии с курсом КЛД ФДПО

Россия, Рязань

Наталья Михайловна Попова

ФГБОУ ВО Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: p34-66@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5166-8372
SPIN-код: 7553-9852
ResearcherId: B-1130-2016

к.м.н., доцент кафедры фармакологии с курсом фармации ФДПО

Россия, Рязань

Александр Александрович Слепнев

ФГБОУ ВО Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Минздрава России

Email: p34-66@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-0696-6554

к.б.н., доцент кафедры фармакологии с курсом фармации ФДПО

Россия, Рязань

Елена Николаевна Якушева

ФГБОУ ВО Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Минздрава России

Email: p34-66@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-6887-4888
SPIN-код: 2865-3080
ResearcherId: T-6343-2017

д.м.н., профессор, зав. кафедрой фармакологии с курсом фармации ФДПО

Россия, Рязань

Список литературы

  1. Якушева Е.Н., Щулькин А.В., Попова Н.М., и др. Структура, функции гликопротеина-Р и его значение для рациональной фармакотерапии // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. 2014. №2. С. 3-11.
  2. Якушева Е.Н., Черных И.В., Щулькин А.В., и др. Методика определения принадлежности лекарственных средств к числу субстратов гликопротеина-P // Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. 2015. №3. С. 49-53.
  3. Гацанога М.В., Черных И.В., Щулькин А.В., и др. Можно ли оценивать принадлежность лекарственных веществ к субстратам гликопротеина-P на самках кроликов породы шиншилла // Наука молодых (Eruditio Juvenium). 2016. №3. С. 5-10.
  4. Щулькин А.В, Черных И.В., Якушева Е.Н., и др. Влияние прогестерона на функциональную активность гликопротеина-Р в эксперименте // Химико-фармацевтический журнал. 2018. Т. 52, №7. С. 3-8. doi: 10.30906/0023-1134-2018-52-7-3-8
  5. Coles L.D., Lee I.J., Voulalas P.J., et al. Estradiol and progesterone-mediated regulation of P-gp in P-gp overexpressing cells (NCI-ADR-RES) and placental cells (JAR) // Molecular Pharmaceutics. 2009. Vol. 6, №6. P. 1816-1825. doi: 10.1021/mp900077q
  6. Fröhlich M., Albermann N., Sauer A., et al. In vitro and ex vivo evidence for modulation of P-glycoprotein activity by progestins // Biochemical Pharmacology. 2004. Vol. 68, №12. P. 2409-2416. doi:10. 1016/j.bcp.2004.08.026
  7. Petri N., Tannergren C., Rungstad D., et al. Transport characteristics of fexofenadine in the Caco-2 cell model // Pharmaceutical Research. 2004. Vol. 21, №8. P. 1398-1404. doi:10.1023/ b:pham.0000036913.90332.b1
  8. Elsby R., Surry D.D., Smith V.N., et al. Validation and application of Caco-2 assays for the in vitro evaluation of development candidate drugs as substrates or inhibitors of P-glycoprotein to support regulatory submissions // Xenobiotica. 2008. Vol. 38(7-8). P. 1140-1164. doi: 10.1080/00498250802050880
  9. Kliewer S.A., Moore J.T., Wade L. An orphan nuclear receptor activated by pregnanes defines a novel steroid signaling pathway // Cell. 1998. Vol. 92, №1. P. 73-82. doi: 10.1016/s0092-8674(00)80900-9
  10. Watanabe K., Jinriki T., Sato J. Effects of progesterone and norethisterone on cephalexin transport and peptide transporter PEPT1 expression in human intestinal cell line Caco-2 // Biological & Pharmaceutical Bulletin. 2006. Vol. 29, №1. P. 90-95. doi: 10.1248/bpb.29.90

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
2. Рис 1. Количество Pgp в клетках линии Caco-2 при воздействии прогестерона (M±SD, нг/мг белка)

Скачать (27KB)
3. 图 1孕酮(MSD,纳克/ 毫克蛋白)对Caco-2细胞系细胞中Pgp含量的影响 注:1—对照(n=7), 2—利福平10微米3天(n=4), 3—孕酮1微米3天 (n=3),4—孕酮10微米3天(n=3),5—孕酮100微米3天(n=3)

Скачать (24KB)

© Ерохина П.Д., Абаленихина Ю.В., Щулькин А.В., Черных И.В., Попова Н.М., Слепнев А.А., Якушева Е.Н., 2020

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС77-76803 от 24 сентября 2019 года