Изучение эффектов антагонистов метаботропных глутаматных рецепторов на модели максимального электрошока у крыс

Полный текст

Эпилепсия и судорожные расстройства относятся к числу наиболее распространенных и тяжелых заболеваний центральной нервной системы (ЦНС). Согласно данным ВОЗ, в мире зарегистрировано более 50 млн больных эпилепсией [1]. Недостаточная эффективность существующих противосудорожных лекарственных средств, имеющих, кроме того, многочисленные побочные эффекты, делает актуальным детальное изучение патогенетических механизмов заболевания [2, 3].

К настоящему времени не вызывает сомнения участие возбуждающих нейротрансмиттерных аминокислот аспартата и глутамата в механизмах возникновения и развития эпилепсии и судорожных состояний [4]. Так, ранее было показано, что при модельной эпилепсии различной природы агонисты глутаматных ионотропных рецепторов являются конвульсантами, а антагонисты, в свою очередь, – антиконвульсантами [5]. В последние десятилетия особую актуальность приобрели исследования, направленные на выяснение роли метаботропных глутаматных (mGlu) рецепторов при нейротоксических повреждениях мозга, включая и судорожные состояния [6, 7]. Показано, что mGlu рецепторы действуют пресинаптически и могут способствовать долговременным изменениям синаптической функции [4]. В ряде исследований выявлено противосудорожное действие модуляторов mGlu рецепторов при экспериментальных судорожных состояниях, вызванных введением различных конвульсивных агентов [7, 8].

Однако, в доступной нам литературе удалось обнаружить всего несколько работ, посвященных изучению эффектов mGlu рецепторов различных подтипов при моделировании судорожных припадков, вызванных воздействием максимального электрошока (МЭШ) [9, 10]. Судороги, вызванные МЭШ, принято рассматривать как одну из наиболее адекватных экспериментальных моделей эпилепсии. Поскольку не существует экспериментальной модели, абсолютно адекватно отображающей патогенез и развитие эпилепсии, наблюдаемой в условиях клиники, общепринятым подходом считается использование различных по своему генезу моделей судорожных расстройств. Модель МЭШ также широко используется при скрининге новых веществ с потенциальной судорожной активностью [11]. Известно, что высокую противосудорожную активность по этому тесту проявляли вещества типа фенитоина и фенобарбитала [11]. Для указанных препаратов характерна способность избирательно предупреждать фазу тонической экстензии судорожного припадка, возникающего в ответ на супермаксимальную электрическую стимуляцию, когда используется 6-кратная по отношению к пороговой сила тока, что составляет для крыс 150 мА при длительности стимуляции 0,2 с [11]. Обнаружено, что антагонисты ионотропных рецепторов (дизоцилпин, NBQX, LY293558), также обеспечивали существенную защиту от тонической фазы судорожного припадка на модели МЭШ [12]. Однако, установлено, что применение всех указанных веществ сопровождалось развитием ряда негативных побочных эффектов [7].

Связь нейромедиаторной функции глутамата с активацией свободнорадикальных процессов послужила основанием для детального изучения возможной роли этих процессов в патофизиологических механизмах таких состояний, как судорожные расстройства и ишемия мозга [13, 14]. В ряде ранее выполненных работ было обнаружено, что модуляция не только N-метил-D-аспартат, но и mGlu рецепторов сопровождается выраженным окислительным стрессом, в том числе и интенсификацией процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в мозге экспериментальных животных [15]. Однако, возможная взаимосвязь mGlu рецепторов и процессов ПОЛ в механизмах судорожных состояний, обусловленных воздействием МЭШ, остается до сих пор практически неизученной.

Цель — изучение влияния антагонистов mGlu рецепторов на развитие судорожного припадка, обусловленного воздействием МЭШ, а также содержание продуктов ПОЛ в мозге крыс.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты проводили на крысах самцах линии Вистар массой 180-210 г. Опыты были выполнены в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденными на заседании этической комиссии ФГБНУ Научно-исследовательский институт нормальной физиологии им. П.К. Анохина (протокол №1 от 03 сентября 2005 г.), а также требованиями Всемирного общества защиты животных (WSPA) и Европейской конвенции по защите экспериментальных животных. Животных содержали в клетках по 4 особи в каждой при свободном доступе к воде и стандартному комбинированному корму. Во избежание влияния суточных ритмов на поведенческие параметры животных все эксперименты проводились в период между 9 и 14 часами при температуре лабораторного помещения 22 ± 1°С.

В работе использовали методику МЭШ (сила тока 150 мА, длительность электростимуляции 0,25 с) [9]. Регистрировали следующие показатели судорожного припадка: появление клонических судорог и полного тонико-экстензорного судорожного припадка с ригидностью задних конечностей (фаза тонической экстензии).

В исследовании были использованы следующие модуляторы mGlu рецепторов: селективный антагонист mGlu рецепторов 5-го подтипа (mGlu5) — 6-метил-2-(фенилэтил) пиридин гидро-хлорид (MPEP; Merz, Германия) и селективный антагонист mGlu рецепторов 1-го подтипа (mGlu1) (R)-N-циклогептил-6-({[(тетрагидро-2-фурил) метил] амино} метил) тиено [2, 3-d] пиримидин-4-иламин (YM-230888; R&D system Tocris, Minneapolis, США). Модуляторы mGlu рецепторов и физиологический раствор вводили крысам однократно внутрибрюшинно (в/б) за 1 час до процедуры МЭШ. Животные, которые не были подвергнуты воздействию МЭШ, получали однократные инъекции исследуемых веществ (в/б) за 1 час до декапитации.

Для проведения исследования животные были разделены на 6 экспериментальных групп:

1-ая группа (контрольная, n = 12) — крысы, которым вводили только физиологический раствор (МЕДПРО, Россия) в объеме 1 мл на 200 г массы животного;

2-ая группа (n = 15) — крысы, которым вводили физиологический раствор за 1 час до процедуры проведения МЭШ;

3-ья группа (n = 14) — крысы, которым вводили только селективный антагонист mGlu5 рецепторов MPEP (20 мг/кг);

4-ая группа (n = 14) — крысы, которым вводили селективный антагонист mGlu1 рецепторов YM-230888 (30 мг/кг);

5-ая группа (n = 16) — крысы, которым за 1 час до воздействия МЭШ вводили MPEP (20 мг/кг);

6-я группа (n = 16) — крысы, которым за 1 час до воздействия МЭШ вводили YM-230888 (30 мг/кг).

YM-230888 диспергировали с 0,1 мл 10% полисорбата твин 80 (PanReac AppliChem, Darmstadt, Германия), затем доводили до нужного объема физиологическим раствором. MTEP растворяли в физиологическом растворе. Дозы препаратов были выбраны, исходя из данных литературы и результатов наших предыдущих исследований [16, 17].

Для определения содержания в ткани мозга вторичных продуктов ПОЛ животных декапитировали под легким эфирным наркозом спустя 1 час после введения исследуемых веществ в группах, которые не подвергали воздействию МЭШ (группы 1, 2, 3) или на высоте развития судорожного припадка, вызванного МЭШ (группы 4, 5, 6). После декапитации мозг извлекали на льду и быстро выделяли фронтальную кору. Образцы ткани для последующих биохимических исследований хранили в жидком азоте. Интенсивность процессов ПОЛ оценивали по уровню продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, используя общепринятый спектрофотометрический метод [18]. К взвешенному образцу ткани мозга добавляли 10-кратное количество охлажденного физиологического раствора, затем гомогенизировали в гомогенизаторе «стекло-тефлон» (0,2 мм) при скорости вращения пестика 3000 об/мин. Из полученной взвеси отбирали 200 мкл гомогената и помещали в пробирку с притертой пробкой. Контрольная проба содержала 200 мкл физиологического раствора. К пробам последовательно добавляли 0,2 мл 45% раствора додецила сульфата натрия (Меrcк, Германия), по 1,5 мл 20% уксусной кислоты (НеваРеактив, Россия) и 8% раствора тиобарбитуровой кислоты (Sigma-Aldrich, Steinheim, Германия) соответственно, а затем доводили объем каждой пробы до 4 мл дистилированной водой. Смесь инкубировали на водяной бане при 95°С в течении 60 мин, после чего пробы охлаждали и центрифугировали 10 мин при 4000 g в центрифуге Armed CH90-1S. Оптическую плотность полученных образцов определяли на спектрофотометре Aminco DW 2000 (США) при длине волны 532 нм. Поглощение образцов интерполировали на стандартные кривые концентрации ТБКРП (ТБК-реагирующие продукты – продукты, реагирующие с 2-тиобарбитуровой кислотой), нмоль/г ткани.

Результаты обрабатывали с помощью пакетов программ Statistica 10.0 (Stat Soft Inc., США), Excel (Microsoft Office 2019, США) и программного обеспечения Bio-Plex Manager (версия 4.1). Полученные данные выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Так как групповые выборки данных не подчинялись закону нормального распределения, для проведения сравнительного статистического анализа применяли непараметрический U-критерий Манна–Уитни для независимых групп. Статистически значимыми считались значения p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В результате наших исследований установлено, что проведение процедуры МЭШ (сила тока 150 мА, длительность электростимуляции 0,2 с) приводило к развитию у 100% животных ярко выраженных судорожных клонико-тонических припадков, заканчивающихся у 93% крыс фазой тонической экстензии задних конечностей. Показано, что при введении антагонистов mGlu рецепторов MPEP (20 мг/кг, в/б) или YM-230888 (30 мг/кг, в/б) без воздействия МЭШ у крыс практически не отмечалось судорожных проявлений (табл. 1). Обнаружено, что селективный антагонист mGlu5 рецепторов MPEP в дозе 20 мг/кг, введенный за 1 час до процедуры МЭШ, практически полностью купировал тоническую фазу судорог. Так, при воздействии МЭШ фаза тонической экстензии была зарегистрирована только у 12% животных этой группы по сравнению с 93% крыс, получавших физиологический раствор (p < 0,01, табл. 1). MPEP в указанной дозе до процедуры МЭШ также приводил к выраженному уменьшению числа животных, у которых отмечались клонические судороги (p < 0,05, табл. 1). В свою очередь, на модели МЭШ при введении селективного антагониста mGlu1 рецепторов YM-230888 в дозе 30 мг/кг тонические судороги, отмечались у 44% экспериментальных животных против 93% у животных, которым вводили физиологический раствор (p < 0,05, табл. 1). При этом ингибирование mGlu1 рецепторов также приводило к достоверному снижению количества животных, у которых отмечался клонический компонент судорожного припадка (p < 0,05, табл. 1).

Таблица 1. Влияние антагонистов метаботропных глутаматных рецепторов на развитие судорожного припадка, вызванного максимальным электрошоком у крыс Вистар

Примечание: n — число животных в группе; * — отличие по сравнению с группой контроля (* — p < 0,05, ** — p < 0,01, *** — p < 0,001); # — отличие по сравнению с группой МЭШ (# — p < 0,05, ## — p < 0,01, ***### — p < 0,001)

При исследовании интенсивности свободнорадикальных процессов выявлено, что проведение процедуры МЭШ сопровождалось более, чем трехкратным увеличением концентрации продуктов ПОЛ в коре мозга крыс по сравнению с таковым в контрольной группе животных (195 ± 19 и 63 ± 11 нмоль/г соответственно, p < 0,001). Введение антагонистов mGlu рецепторов (MPEP, 20 мк/кг и YM-230888, 10 мг/кг) без воздействия МЭШ не вызывало значимых изменений уровня ТБКРП продуктов в коре мозга крыс по сравнению с контрольной группой. Установлено, что ведение MPEP за 1 час до судорожного агента в значительной степени, но не полностью предотвращало увеличение содержания продуктов ПОЛ, вызванную МЭШ (рис. 1, p < 0,01). Селективный антагонист mGlu1 рецепторов YM-230888 также частично уменьшал интенсификацию процессов ПОЛ, обусловленную воздействием МЭШ (рис. 1, p < 0,05).

Рис. 1. Влияние антагонистов метаботропных глутаматных рецепторов на содержание продуктов перекисного окисления липидов в коре мозга крыс на модели максимального электрошока.

Примечание: * — по сравнению с контрольной группой, # — по сравнению с группой МЭШ (* и # — p < 0,05; ** и ## — p < 0,01).

Таким образом, в результате исследований установлено, что глутаматные рецепторы метаботропного типа (mGluR1 и mGluR5) вовлечены в механизмы развития судорожных припадков, вызванных процедурой МЭШ. В настоящее время не вызывает сомнения, что в основе развития эпилепсии и судорожных расстройств лежит дисбаланс между возбуждающей и тормозной нейротрансмиссией [4]. Однако, на сегодняшний день в клиническую практику для лечения судорожных состояний внедрены несколько препаратов, влияющих на тормозную (ГАМК — γ-Аминомасляная кислота) нейротрансмитерную систему [19]. При этом, попытки создания противосудорожных препаратов, действие которых направлено непосредственно на модуляцию активности глутаматных рецепторов, оказались малопродуктивными [5]. Это странно, но одним из возможных объяснений является то обстоятельство, что ранее разработка противосудорожных средств была нацелена на синтез молекул, которые блокируют ионотропные рецепторы глутамата. Эти рецепторы обеспечивают быструю возбуждающую синаптическую передачу в ЦНС, но оказывают ряд серьезных побочных эффектов [6]. Решение проблемы клинического применения лигандов глутаматных рецепторов лежит, по-видимому, в использовании модуляторов неионотропных глутаматных рецепторов [6]. Так, показано, что антагонисты mGlu1 и mGlu5 рецепторов ослабляют возбуждающий эффект глутамата путем функциональной модуляции N-метил-D-аспартат подтипа глутаматных рецепторов на модели судорог, вызванных введением этанола [7]. В наших ранее выполненных экспериментах было обнаружено [16], что блокада mGlu1 рецепторов полностью предотвращала как развитие аудиогенных судорог, так и интенсификацию процессов ПОЛ в мозге мышей DBA/2 в ответ на звуковое воздействие, в то время как активация этих рецепторов вызывала увеличение интенсивности судорожных проявлений и усиление образования продуктов ПОЛ в мозге мышей с генетически обусловленной эпилепсией [16]. При изучении возможной взаимосвязи процессов ПОЛ и модуляции mGlu рецепторов на модели судорожного припадка, вызванного процедурой МЭШ, было обнаружено, что антагонист mGlu5 рецепторов MPEP почти полностью подавлял развитие тонической экстензии и, в значительной степени, предотвращал интенсификацию процессов ПОЛ. Следует отметить, что антагонист mGlu1 рецепторов YM-230888 в условиях данной модели также, хотя и в меньшей степени, предупреждал развитие тонических судорог, а также усиление образования продуктов ПОЛ в коре мозга крыс. Полученные результаты свидетельствуют об ингибирующем влиянии антагонистов mGlu рецепторов на интенсификацию процессов ПОЛ в мозге крыс. В литературе имеются данные об антиконвульсантной активности препаратов с антиоксидантным механизмом действия, таких как мексидол [20] и мелатонин [14]. Суммируя полученные нами результаты и данные литературы можно предположить, что снижение активности процессов ПОЛ является необходимым звеном в механизмах действия препаратов с антиконвульсантной активностью.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, глутаматные рецепторы метаботропного типа (mGluR1 и mGluR5) вовлечены в механизмы развития судорожных припадков, вызванных воздействием максимальным электрошоком у крыс. При этом наиболее выраженное ослабление конвульсивных проявлений на модели максимального электрошока отмечалось при блокаде mGlu5 рецепторов, тогда как ингибирование mGlu1 рецепторов было менее эффективно. Установлено, что введение антагонистов mGlu5 и mGlu1 рецепторов частично предотвращало повышение уровня продуктов перекисного окисления липидов, обусловленное воздействием максимального электрошока в коре мозга крыс.

Полученные данные подтверждают возможность использования антагонистов метаботропных рецепторов 5-го подтипа как потенциальных противоэпилептических средств при генерализованных судорожных припадках.

ДОПОЛНИТЕЛЬНО

Источник финансирования. Бюджет Научно-исследовательского института нормальной физиологии им. П.К. Анохина.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов: Башкатова В.Г. — сбор и обработка материала, концепция исследования, написание текста, Судаков С.К. — дизайн исследования, редактирование.

Об авторах

Валентина Германовна Башкатова

Автор, ответственный за переписку.
Email: v.bashkatova@nphys.ru
ORCID iD: 0000-0001-6632-5973
SPIN-код: 7383-8483

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории физиологии подкрепления

Сергей Константинович Судаков

Email: s-sudakov@nphys.ru
ORCID iD: 0000-0002-9485-3439
SPIN-код: 1127-4090
ResearcherId: D-1647-2013

д.м.н., проф., чл.-корр. РАН, директор, зав. лабораторией физиологии подкрепления

Список литературы

Дополнительные файлы

Доп. файлы

Действие

1. JATS XML

Скачать

2. Рис. 1. Влияние антагонистов метаботропных глутаматных рецепторов на содержание продуктов перекисного окисления липидов в коре мозга крыс на модели максимального электрошока.

Скачать (41KB)

Метаданные