Проточно-цитометрическое исследование содержания ДНК в опухолевых клетках больных раком легкого с паранеопластическим ревматологическим синдромом

Полный текст

Как известно, большинство злокачественных опухолей состоит из гетероплоидных популяций клеток, которые характеризуются изменениями структуры и количества хромосом (анеуплоидия и полиплоидия) и соответственно изменением содержания ДНК в ядрах клеток [1, 12]. Так, полиплоидные опухоли чаще всего более злокачественные, чем диплоидные, они более инвазивны, быстрее растут и метастазируют [2, 8]. При этом клетки полиплоидных опухолей обладают большей жизнеспособностью и приспособительной реакцией к разнообразным условиям микроокружения [13, 14]. Современный метод проточной ДНК-цитометрии позволяет с высокой точностью произвести анализ большого количества клеток и определить различные показатели клеточного цикла. В основе метода лежит измерение флюоресценции специальных красителей (маркеров), избирательно связывающихся с ДНК [3, 5]. Результаты современных ретроспективных и проспективных исследований свидетельствуют о том, что показатели содержания ДНК определенные с помощью проточной цитометрии характеризуют степень гетероплоидности клеток опухоли и их пролиферативную активность. Эти исследования дополняют общепринятые признаками оценки опухолевого процесса (размер первичной опухоли, степень распространения опухоли и др.) и являются существенными прогностическими факторами при многих злокачественных новообразованиях [4, 6, 7, 10]. Как известно, рак легкого относится к высокозлокачественным опухолям. Довольно часто он сочетается с паранеопла-стическим ревматологическим синдромом (ПНРС) [9, 11]. В настоящее время все больший интерес у исследователей вызывает изучение ДНК-цитометрического профиля у больных злокачественными 128 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №4, 2013 г. опухолями, в том числе и раком легкого. Информации относительно анализа содержания ДНК в опухолевых клетках больных раком легкого с наличием ПНРС мы не обнаружили. Цель исследования - определение и сравнительный анализ содержания ДНК в опухолевых клетках больных раком легкого с наличием и без ПНРС. Материалы и методы В исследование вошли 70 больных раком легкого, которые находились на лечении в торакальном отделении Винницкого областного клинического онкологического диспансера. Все больные были разделены на две группы. Первая группа - 40 больных раком легкого без наличия ПНРС, вторая - 30 пациентов с раком легкого с проявлениями ПНРС. Забор опухолевого материала осуществлялся во время операций, который до проведения исследования хранился в замороженном состоянии. Содержание ДНК в ядрах опухолевых клеток определяли методом проточной ДНК-цитометрии. Суспензии ядер из опухолевых клеток получали с помощью специального раствора для исследования ядерной ДНК CyStain DNA Step 1 (Partec, Германия) согласно протокола-инструкции фирмы производителя. Данный раствор позволяет маркировать ядерную ДНК диа-мидинофенилиндолом (DAPI), который входит в его состав. В процессе приготовления нуклеарных суспензий использовались специальные одноразовые фильтры CellTrics 50 мкм (Partec, Германия). Регистрацию данных выполняли на многофункциональном научно-исследовательском проточном цитометре "Partec PAS" (Partec, Германия) с применением программного обеспечения FloMax (Partec, Германия) в научно-исследовательском центре Винницкого национального медицинского университета имени Н.И. Пирогова. Для возбуждения флюоресценции DAPI применялось УФ-излучение. С каждого образца нуклеарной суспензии анализу подвергалось 20 тыс. событий. Циклический анализ клеток выполнялся средствами про граммного обеспечения Modfit LT for Windows 4.0 (Verity Software House, USA). Определяли показатели: количество диплоидных и анеуплоидных клеток в образце (%), распределение клеток каждой популяции по фазам клеточного цикла (G0G1, S, G2 + M). Также вычисляли специальные индексы, которые характеризуют ДНК ане-уплоидию: DI (индекс ДНК - характеризует отношение интенсивности флюоресценции пика анеуплоидных клеток к диплоидному), CI (клеточный индекс) и AI (индекс ане-уплоидии) [10]. CI = AnC / (AnC + DiC) и AI = (AnC х DI + DiC х 1) / (AnC + DiC), где AnC - количество анеуплоидных клеток в G0G1 фазе по отношению к общему количеству анеуплои-дных клеток; DiC - количество диплоидных клеток в G0G1 фазе по отношению к общему количеству диплоидных клеток. Исследование апоптоза (фрагментации ядерной ДНК) выполнено путем выделения SUB-G0G1 участка на ДНК-гистограммах перед пиком G0G1, указывающего на ядра клеток с содержанием ДНК < 2c. Для оценки количественных результатов исследования определяли значение среднего (М) и ошибку среднего (m) -M±m. Для сравнения средних показателей двух различных исследуемых групп использовали параметрический t-критерий Стьюдента. Статистическую обработку проводили с помощью программного обеспечения для статистического анализа "Biostat" и "MS Ехсєі XP". Результаты и их обсуждение При проведении анализа показателей проточной ДНК-цитометрии опухолевых клеток больных раком легкого установлено наличие отличительных молекулярнобиологических характеристик этих опухолей в зависимости от наличия ПНРС. Так выявлено, что при диплоидном варианте опухоли, статистически достоверной между двумя группами является разница в содержании клеток в G0G1 и S фазах клеточного цикла (табл. 1). Количество опухолевых клеток в G0G1 фазе клеточного цикла у больных раком легкого без ПНРС составляло 87,09±1,69 %, в то время как у 129 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №4, 2013 г. больных раком легкого с наличием ПНРС значение этого показателя было меньше на 9,04 % (р<0,05) и составляло 79,87±1,82 %. Параллельно, уменьшение содержания клеток в G0G1 фазе клеточного цикла сопровождается повышением содержания клеток в S и G2 + M фазах. Так, у больных раком легкого с наличием ПНРС содержание опухолевых клеток в S фазе было в 2,21 раза больше (р<0,01) чем у пациентов без данного синдрома - 13,99±1,43 % и 6,33±1,66 % соответственно. Это свидетельствует о повышенной пролиферативной активности опухолевых клеток больных второй группы. Если сравнивать распределение опухолевых клеток больных раком легкого по фазам клеточного цикла при анеуплоид-ном варианте опухоли видно, что общее количество диплоидных клеток у больных второй группы (51,94±3,47 %) на 23,01 % меньше (р<0,05), чем у больных первой группы (13,99±1,43 %). Соответственно и общее содержание анеуплоидных клеток (48,06±3,47 %) у пациентов раком легкого с наличием ПНРС на 33,09 % больше (р<0,05) нежели у пациентов раком легкого без данного синдрома (36,11±2,72 %). Также следует отметить, что содержание опухолевых клеток в S-фазе (30,37±2,20 %) у больных раком легкого с наличием ПНРС на 33,38% больше (р<0,01) нежели у больных без ПНРС (22,77±2,50 %). Анализируя показатели клеточного цикла опухолевых клеток больных раком легкого выявлены следующие изменения связанные с наличием у больных ПНРС (табл. 2). Так, при диплоидном профиле опухоли у больных раком легкого с наличием ПНРС, наблюдается повышенная ДНК-синтетическая и пролиферативная активность опухолевых клеток по сравнению с пациентами без ПНРС. Подтверждение этому - общее содержание клеток в S-фазе (13,99±1,43 %) у больных второй группы в 2,21 раза больше (р<0,01), чем у больных первой группы (6,33±1,66 %). Также было установлено, что при ане-уплоидном профиле опухоли существует достоверная разница между двумя группами в таких показателях, как общее ко личество клеток в S-фазе, апоптотическая активность, индекс ДНК, клеточный индекс и индекс анеуплоидии. Общее количество опухолевых клеток в S-фазе у пациентов раком легкого с наличием ПНРС (18,73±1,78 %) на 51,05 % больше (р<0,05) нежели у пациентов раком легкого без ПНРС (12,4±1,74 %). В тоже время апоптотическая активность опухолевых клеток у больных второй группы была достоверно ниже по сравнению с аналогичным показателем больных первой группы: 6,55±0,88 % и 11,71±1,83 % соответственно, т.е. на 78,78 % (р<0,05). При сравнении значений индексов, которые характеризуют анеуплоидию ДНК (табл. 2), видно, что у больных раком легкого с ПНРС средние значения DI, CI и AI достоверно выше аналогичных показателей больных без данного синдрома. Так, индекс ДНК у больных второй группы (1,78±0,07) был значительно выше на 32,84 % (р<0,01), чем у больных первой группы (1,34±0,08). Также были большими значения и клеточного индекса (0,4±0,04) у пациентов раком легкого с проявлениями ПНРС по сравнению с аналогичным показателем (0,29±0,03) у пациентов без данного синдрома, соответственно на 37,93 % (р<0,05). Значения индекса анеуплоидии у больных второй группы были больше на 18,92 % (р<0,01), чем у больных контрольной группы (1,32±0,04 и 1,11±0,03 соответственно). При анализе ДНК-цитометрических показателей опухолевых клеток больных раком легкого обеих групп, наблюдается следующее. Полученные данные свидетельствуют, что опухоли больных раком легкого с проявлениями ПНРС в отличие от опухолей больных без данного синдрома характеризуются повышенной про-лиферативной активностью с одновременно пониженной апоптотической активностью опухолевых клеток. Также в опухолях больных раком легкого с наличием ПНРС наблюдаются более высокие индексы анеуплоидии ДНК, что дополнительно подтверждает их более злокачественное течение. 130 Таблица 1 Распределение опухолевых клеток больных раком легкого по фазам клеточного цикла в зависимости от наличия ПНРС (M ± m) Характеристика групп больных по профилю опухоли Показатели клеточного цикла, % Диплоидные клетки Анеуплоидные клетки Всего G0G1 S G2 + M Всего G0G1 S G2 + M Рак легкого без ПНРС, n=40 Диплоидный 100 87,09±1,69 6,33±1,66 6,58±0,54 - - - - Анеуплоидный 63,89±2,72 83,37±2,35 7,83±1,84 8,8±2,3 36,11±2,72 59,97±4,76 22,77±2,5 17,26±3,49 Рак легкого с ПНРС, n=30 Диплоидный 100 79,87±1,82** 13,99±1,43* 6,15±0,77 - - - - Анеуплоидный 51,94±3,47** 81,96±2,38 11,14± 1, 8 6,9±1,69 48,06±3,47** 55,13±2,57 30,37±2,2* 14,5±1,4 Примечание: * - р <0,01 относительно показателей соответствующего профиля опухоли у больных первой группы ** - р <0,05 относительно показателей соответствующего профиля опухоли у больных первой группы Таблица 2 ДНК-цитометрические показатели опухолевых клеток больных раком легкого в зависимости от наличия ПНРС (M ± m) Характеристика групп больных по профилю опухоли Общая фаза S, % SUB-G0G1 (апоптоз), % Индекс ДНК, DI Клеточный индекс, CI Индекс анеуплоидии, AI Рак легкого без ПНРС, n=40 Диплоидный 6,33±1,6 11,38±3,03 - - - Анеуплоидный 12,4±1,74 11,71±1,83 1,34±0,08 0,29±0,03 1,11±0,03 Рак легкого с ПНРС, n=30 Диплоидный 13,99±1,42* 8,33±1,26 - - - Анеуплоидный 18,73±1,78** 6,55±0,88** 1,78±0,07* 0,4±0,04** 1,32±0,04* Примечание: * - р <0,01 относительно показателей соответствующего профиля опухоли у больных первой группы ** - р <0,05 относительно показателей соответствующего профиля опухоли у больных первой группы Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №4, 2013 г. Выводы 1. Установлено наличие отличительных молекулярно-биологических характеристик опухолевых клеток, свидетельствующих о более злокачественном течении заболевания у больных раком легкого с проявлениями паранеопластического ревматологического синдромома. 2. В опухолях больных раком легкого с паранеопластическим ревматологическим синдромом наблюдается достоверно более высокая пролиферативная активность опухолевых клеток в отличие от аналогичных показателей у пациентов без паранеоплас-тического ревматологического синдрома (общее количество клеток в S-фазе при диплоидном типе опухоли выше в 2,21 раза, при анеуплоидном - на 51,05 %). 3. Уровень апоптоза (фрагментации ДНК) достоверно ниже на 78,78 % при анеуплоидном типе опухоли у больных с проявлениями паранеопластического ревматологического синдрома в отличие от аналогичных показателей у пациентов без данного синдрома, что может свидетельствовать о более неблагоприятном прогнозе. 4. Более высокие показатели, которые характеризуют анеуплоидию ДНК клеток опухолевой ткани у пациентов раком легкого с паранеопластическим ревматологическим синдромом (DI выше на 32,84 %, CI - на 37,93 %, AI - на 18,92 %), по сравнению с аналогичными показателями у пациентов без данного синдрома, подтверждают у них более высокую агрессивность и злокачественность опухолевого процесса.

Список литературы

Дополнительные файлы