Пролиферативная активность и дифференцировка стволовых клеток почек при суперинвазионном описторхозе (экспериментальное исследование)

Полный текст

Описторхоз, трематодоз — паразитарное заболевание, вызываемое кошачьей двуусткой — Opisthorchis felineus. Заболевание имеет системный характер с повреждением экониш, где вегетируют паразиты: печени, поджелудочной железы, желчного пузыря [1, 2]. Клиническая и патологоанатомическая практики показывают, что гельминты вызывают существенные изменения в органах и системах, где они не паразитируют, т.е. изменения происходят также вне экониш описторхисов: в легких, почках и т.д. Наиболее выражены эти проявления при гиперэозинофильном синдроме, вследствие многочисленных ранних и поздних суперинвазий [3, 4]. Описторхисы содержат в составе секретома белок гранулин, который оказывает выраженный пролиферативный эффект, в результате — мутации многочисленных пролиферативных генов [5, 6]. Ранее было показано, что у лабораторных животных описторхозная инвазия экспрессирует многочисленные гены: c-Kit, AРC, K-ras, B-raf, WE6F, VEGFR и др., что объясняется реакцией паразита для обеспечения особей трофическим субстратом — холангиоцитами. Происходит индуцирование регионарных стволовых клеток печени (репликативного потенциала) к пролиферации и дифференцировке по правилу H. Leduc (1964) на холангиоцелюлярный и гепатоцеллюлярный (ГЦД) диффероны; одновременно (15 сут эксперимента) наблюдаются активные процессы неоангиогенеза: васкулогенез — формирование сосудов из прогениторных клеток — и ангиогенез — из сосудистой сети, вследствие кинетических процессов эндотелия и перицитов предсуществующих капилляров [7].

В клинике состояние почек при описторхозе изучено недостаточно. У пациентов с хроническим описторхозом наблюдали протеинурию, гематурию, цилиндурию; многие исследователи связывают эти проявления с аллергической реакцией на описторхисов [8, 9]. Также были описаны случаи иммунного гломерулонефрита с нефротическим синдромом при остром описторхозе, проявлением которого служит выраженная нефропатия [10, 11]. Морфогенетических исследований по инициации и кинетике собственных стволовых клеток почек при описторхозе не проводилось, остается неизвестной реакция репликативного потенциала почек на инициирующий субстрат описторхисов — секретом (гранулин), что является важным при выявлении репаративных процессов при частичных резекциях этого органа.

Цель — выявить реакции репликативного потенциала почек при различных формах описторхоза у лабораторных животных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперимент проведен на 60 сирийских хомяках-самцах (Syrian golden hamster) массой 95,0 ± 10,0 г. Животные разделены на 3 группы:

I — контрольная — 10 животных;

II — опытная — 25 хомяков, заражение животных проводилось 50 метацеркариями O. felineus;

III — моделирование суперинвазионной формы описторхоза (СО) — заражение 50 личинками O. felineus, повторное заражение 50 метацеркариями через 14 и 25 сут.

Метацеркарии выделялись по методике Г.А. Глазкова [12] из язей (Leuciscus idus) одного биотопа. Все манипуляции с животными проводили согласно положениям Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным и Приказу МЗ РФ № 267 от 19 июня 2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики». Из эксперимента хомяки выводились посредством передозировки наркоза с последующей декапитацией на 7, 15, 30 сут опыта.

Срезы почечной ткани после стандартных гистологических манипуляций окрашивали гематоксилином и эозином, по Ван-Гизону. Депарафинирование, демаскировку антигеном и иммуногистохимические реакции проводили в соответствии со стандартными протоколами с использованием автостейнера Bond Max (Leica Biosystems, США). Иммуногистохимические исследования проводили с применением маркеров CD34 (Lab Vision Corportation, США; клон — QBEnd/10, Cell Marque), CD31 (Novokastra, США; клон — JC70, Cell Marque), Oct-4 (Lab Vision Corportation, США; клон — MRQ-10, Cell Marque), CD117 (Lab Vision Corportation, США; клон — YR145, Cell Marque) и Ki-67 (RTU, США; клон — MIB-1, Agilent/Dako). Результаты иммуногистохимической реакции оценивали путем полуколичественных и количественных характеристик: интенсивность реакции по шкале от 0 до 3 баллов (0 — реакция отсутствует, 1 — слабая реакция, 2 — умеренная реакция, 3 — выраженная реакция) и количество позитивно окрашенных клеток в 1 поле зрения (п.з.; при увеличении х400). Подсчет количества позитивно окрашенных клеток выполняли в 10 п.з. при увеличении х400 и рассчитывали среднее арифметическое. Изучение стеклопрепаратов проводили на микроскопе Axio Lab.A1 (Carl Zeiss Microscopy, Германия) с дальнейшей морфометрической оценкой количественных параметров.

Статистическая обработка результатов выполнена с использованием пакета прикладных программ Office Excеl 2007 (Micrоsoft, США) на IBMPC/AT Pentium-IV в среде Windows 7.0. Результаты представлены в долях (%), в виде медианы (Ме), нижнего (Q25) и верхнего (Q75) квартилей. Сравнение проводили с использованием непараметрического метода Манна–Уитни. Уровень статистической значимости — р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На 7 сут после заражения в опытной группе при макроскопическом и гистологическом исследовании изменения в почках минимальны. Морфологические изменения были сходны и соответствовали морфологической картине, наблюдаемой в контрольной группе. В группе с СО отмечался очаговый отек интерстиция и незначительная лимфоидная инфильтрация в корковом веществе; в клубочках значимых изменений не обнаружено.

Микроскопическая картина почек на 15 сут эксперимента у животных II и III групп значительно отличалась от группы I (контроль): регистрировали морфологические изменения разной степени выраженности в различных отделах нефрона. Наблюдали увеличение размера клубочков с умеренным сдавлением капиллярных петель, в некоторых из них выявляли очаговый склероз капсулы и капиллярных петель. В корковом веществе отмечали вакуолизацию цитоплазмы некоторых клеток эпителия извитых канальцев. В проксимальных канальцах присутствовали признаки гиалиново-капельной дистрофии, фокально регистрировали признаки некробиоза. Фиксировали частичное слущивание десквамированного эпителия с образованием мелких очагов денудации, также обнаруживали очаги фиброза и склероза. Установлено, что при СО до 28% клубочков были гипертрофированными, тогда как во второй группе такое изменение клубочков наблюдали на поздних сроках. При этом, до 10% клубочков находились в колабированном состоянии с начинающимися признаками гломерулосклероза, что сопровождалось стазом в капиллярах почечного тельца.

В строме почек и в стенке канальцев во второй группе (разовое заражение метацеркариями O. felineus) наблюдали увеличение показателей маркера CD31, в клубочковом аппарате — умеренную экспрессию маркера CD34, что свидетельствует об активации стволовых клеток в данных структурах (рис. 1 А, Б, В).

 

Рис. 1. Группа с СО 15 сут эксперимента: А — выраженная пролиферация почечных канальцев. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х40; Б — мембранная экспрессия маркера CD34 в почечных канальцах. Иммуногистохимическая реакция с CD34. Увеличение х20; В — цитоплазматическая экспрессия маркера CD31 в клубочках. Иммуногистохимическая реакция с CD31. Увеличение х10; Г — близкое расположение клубочков с умеренным склерозом. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х20.

 

Кроме этого, обнаружено повышение числа почечных капилляров в самом клубочке (в I группе — 31,00 ± 12,74). В третьей группе (суперинвазионная форма описторхоза) выявлена выраженная пролиферация стволовых и прогениторных клеток в формирующихся сосудах, а также эпителиальных структур канальцев (табл. 1).

На 30 сут эксперимента в просвете извитых канальцев наблюдали зернистые цилиндры. Вблизи клубочков обнаружены воспалительные инфильтраты в виде лимфомононуклеаров. В препаратах выявляли очаговый интерстициальный фиброз, который был более выражен, чем в опытной группе. Наблюдали сегментацию клубочков, сопровождавшуюся увеличением количества капилляров почечного тельца. Они были гипертрофированы, располагались близко друг к другу, часть находилась в выраженном склерозе в сравнении со второй группой эксперимента (рис. 1 Г).

В нефронах регистрировали увеличение диаметра клубочка и его площади в сравнении с группой первичного заражения описторхами (рис. 2 А). Здесь отмечена выраженная экспрессия маркеров CD31 и Oct-4 (рис. 2 Б, В) и выраженная пролиферация многослойного переходного эпителия в лоханке (рис. 2 Г).

В ходе эксперимента было установлено, что в стенке почечных канальцев выявляется более высокий регенераторный потенциал по сравнению с клубочками, т.к. в данных структурах при суперинвазионном описторхозе наблюдается экспрессия маркера CD34, Oct-4, CD117. При исследовании пролиферативной активности экспрессия маркера Ki-67 в данных структурах выше, чем в клубочковом аппарате.

Практика патологоанатомических вскрытий пациентов, умерших с суперинвазионным описторхозом в гиперэндемичном очаге, показала редкое участие почек как основного компонента непосредственной причины смерти.

 

Таблица 1. Экспрессия моноклональных антител в группах наблюдения на 15 сут эксперимента, Ме (Q25–Q75)

Маркеры	Строма			Паренхима
	I группа	II группа	III группа	I группа	II группа	III группа
CD34, кл/мм2	3,60 ± 1,24 (1,76 - 4,84)	11,70 ± 2,78** (8,92 - 14,48)	17,80 ± 5,87** (11,93 - 23,67)	2,70 ± 1,25 (1,45 - 3,95)	10,70 ± 0,43** (10,27 - 11,13)	11,80 ± 0,54* (11,26 - 12,34)
Oct4, кл/мм2	4,60 ± 3,85 (0,75 - 8,45)	12,70 ± 5,41* (7,29 - 18,11)	39,50 ± 16,19* (23,31 - 55,69)	0,40 ± 0,20 (0,20 - 0,60)	1,20 ± 0,09** (1,11 - 1,29)	1,90 ± 0,95* (0,95 - 2,85)
CD117, кл/мм2	1,06 ± 0,78 (0,28 - 1,84)	7,08 ± 3,48** (3,60 - 10,56)	19,97 ± 7,93** (12,04 - 27,90)	1,45 ± 0,68 (0,77 - 2,13)	2,70 ± 1,10* (1,60 - 3,80)	3,60 ± 3,50** (0,10 - 7,10)
CD31, кл/мм2	2,10 ± 0,74 (1,36 - 2,84)	8,40 ± 0,68** (7,72 - 9,08)	14,55 ± 5,65* (8,90 - 20,20)	4,80 ± 0,80 (4,0 - 5,6)	8,40 ± 1,08** (7,32 - 9,48)	10,80 ± 0,45* (10,35 - 11,25)
Ki-67, %	1,6	3,0**	9,0*	0,8	2,4*	7,6**

Примечание: * — статистически значимые различия в сравнение с I группой, р < 0,05, ** — статистически значимые различия в сравнение с I группой, р < 0,01. Каждый маркер анализировался в 10 п.з. при увеличении объектива х400

 

Рис. 2. Группа с СО на 30 сут эксперимента: А — повышение количества петель в клубочках. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х40; Б — мембранная экспрессия маркера CD31 в почечных клубочках. Иммуногистохимическая реакция с CD31. Увеличение х10; В — ядерная экспрессия маркера Oct4 в почечных клубочках. III группа. Иммуногистохимическая реакция с Oct4. Увеличение х20; Г — пролиферация переходного эпителия лоханки. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х40.

 

Исключение составляют выраженное системное воспаление (сепсис) и развитие хронической болезни почек на фоне диффузного иммунокомлексного гломерулонефрита. Можно предположить, что активный васкулогенез, т.е. СD-34–положительные (эндотелиальные) клетки, позволяет обогащать клубочки дополнительными функциональными структурами и усиливать компенсаторные возможности органов в целом. Следует отметить, что при суперинвазионном описторхозе формируется неоангиогенез, подразделяющийся на ангиогенез — трихотомическое ветвление из существующих сосудистых образований и васкулогенез — развитие сосудов de novo из стволовых клеток. Последний процесс наблюдается в различных органах независимо от места вегетирования паразита [2, 7].

Важную роль в организации микроциркуляторного русла почки имеют перициты. Как известно, они активно экспрессируют васкулоэндотелиальный фактор роста (VEGF), поэтому выявленная активность маркера CD31 достигает 3 баллов, что подтверждает факт того, что подоциты, образуя обширную сеть вокруг капилляров, активно участвуют в процессе ангиогенеза и созревании сосудов при воздействии секретома O. felineus. В целом, число петель в клубочках при СО увеличивается на 24,3% (67,4 ± 3,6). Кроме этого, при использовании гистохимических окрасок было подтверждено, что умеренные склеротические изменения вокруг клубочкового аппарата являются следствием активации фибробластического дифферона.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Установлено, что секретом O. felineus инициирует активацию стволовых клеток в почечных канальцах и перицитов микроциркуляторного русла. Выявлена активная пролиферация переходного эпителия лоханок и начальных отделов мочеточника. Под действием секретома паразита наблюдается выраженная пролиферация стволовых клеток в петлях клубочков, что может оказывать протекторный эффект при критических состояниях организма хозяина паразитов.

ДОПОЛНИТЕЛЬНО

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов: Урузбаев Р.М. — сбор, перевод и анализ материала, написание текста, Бычков В.Г., Вихарева Л.В. — редактирование, Молокова О.А. — концепция литературного обзора, редактирование.

Об авторах

Ринат Маратович Урузбаев

Тюменский государственный медицинский университет; Многопрофильный клинический медицинский центр «Медицинский город»

Автор, ответственный за переписку.
Email: uruzbaevrm@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6883-0543

к.м.н., доцент кафедры патанатомии и судебной медицины

Россия, Тюмень; Тюмень

Виталий Григорьевич Бычков

Тюменский государственный медицинский университет

Email: uruzbaevrm@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0211-2669

д.м.н., профессор, профессор кафедры патанатомии и судебной медицины

Россия, Тюмень

Лариса Владимировна Вихарева

Тюменский государственный медицинский университет

Email: vihareva@tyumsmu.ru
ORCID iD: 0000-0001-6864-4417

д.м.н., профессор, зав. кафедрой анатомии человека, топографической анатомии и оперативной хирургии

Россия, Тюмень

Ольга Александровна Молокова

Тюменский государственный медицинский университет

Email: molokova_tyumsmu@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3736-3089

д.м.н., доцент, профессор кафедры патанатомии и судебной медицины

Россия, Тюмень

Список литературы

Дополнительные файлы