Causes of length of conotruncus of embryonic mouse heart at normal condition and under the maternal dehydration

Abstract

This work presents the histogenetic transformation from conotruncus of embryonic mouse heart (С57BL/6) under the normal and experimental condition. It was establish the reason of the shortening of the conotruncus of embryonic heart was delayed physiological proliferative activity of the cells of myocardial cuff during our research.

Full Text

Группа врожденных конусностволовых дефектов сердца у детей является первоочередной среди врожденных пороков сердца по возможностям комбинирования с другими пороками и вовлечения в состав субклинических персистирующих дефектов [2]. Большинство работ, посвященных аномалиям кардиогенеза, базируются на использовании моделей различных патологических состояний, тогда как влияние дегидратации материнского организма на гисто-генетические перестройки эмбрионального сердца остается открытым вопросом. При этом обезвоживание организма матери разной степени тяжести сопровождает ряд заболеваний первого триместра беременности (гестозы, экстрагенитальная патология). Сложность гистогенетических перестроек конусно-стволового отдела эмбрионального сердца на пути формирования магистрального сосудистого поля в достаточно короткий период времени обусловливает выбор именно этого отдела сердца для предпочтительной экспериментальной модели [5, 12]. Целью нашей работы было определить гистогенетические перестройки конусно-стволового отдела (КСО) сердца эмбриона мыши, которые лежат в основе изменения его длины на этапах формирования и развития производных в экспериментальных и нормальных условиях. Среди причин уменьшения длины КСО или «абсорбции луковицы» [4] на сегодня выделяют редукцию конденсированной мезенхимы или клеток нервного гребня путем апоптоза [7]; миокардиали-зацию подушек ствола и гребней конуса, что приводит к уменьшению миоидных клеток КСО [8]; гистогенетические перестройки миокардиальной манжетки. Материалы и методы В работе использовано 127 сердец эмбрионов мышей линии С56BL/6 в условиях нормы и 64 - в условиях дегидратации материнского организма, взятых в период с 10-о по 15-й день гестации (16-24 стадия по K. Theiler) [11]. Среди представленных патологических моделей обезвоживания организма была выбрана модель дегидратации в условиях перорального приема гиперосмолярного раствора. Согласно данным модели эксперимента M.J. McKinley с коллегами, выполненной именно на мышах линии С56BL/6, экспериментальным был выбран вариант введения раствора 0,3 моль/л NaCl с дальнейшей 7 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №4, 2013 г. водной депривацией [9]. В качестве обез-боливаливающего препарата был выбран тиопентал натрия (3-5 мг/кг в/м), животные умертвлялись путем декапитации. Материал фиксировали в растворе 10%-ного забу-ференого формалина, обезвоживали и заливали в парапласт. Серийные срезы толщиной 5, 7 мкм окрашивали гематоксилином-эозином и по Стидмену. Для создания трехмерных моделей использовали программное обеспечение Photoshop CS5 (подготовка фотографий), Amira for microscopy 5.0 (создание и измерение контуров), 3ds max 8.0 (окончательная обработка и визуализация). Реконструкцию проводили согласно рекомендациям [4]. Для выявления степени пролиферативной активности ядер отдельных клеточных популяций КСО был выбран маркер - моноклональные антитела Ki-67, клон Sp6. Для определения гладких миоцитов КСО использовался маркер а-глад-комышечного актина (aSMA). Иммуногистогимические реакции проводились с использоанием системы визуализации LSAB (Labelled Streptavidin Biotin) (LabVision). Были использованы гистологические, морфометрические [1], стереологи-ческие, иммуногистохимические, биометрические методы [3], а также трехмерное компьютерное моделирование. Результаты и их обсуждение Исследования показали, что длина КСО на 10-й день (16 стадия по Тейлеру) эмбриогенеза составляла 301±25 мкм. При этом индекс пролиферации ядер миоцитов миокардиальной манжетки равнялся 22,4±3,4%, тогда как пролиферативный индекс ядер кардиомиоцитов правого желудочка 23,6±2,5%. В срок 10,5 суток кардиогенеза (стадия 17 по Тейлеру) КСО достоверно удлинялся на 28,4%, в сравнении с предыдущей стадией. Начинался манжетковый этап миокардиализации. Согласно результатам исследования N. Okamoto с коллегами термин «миокардиализация» трактовался, как начало трансдифференцировки миоцитов миокардиальной манжетки в мезенхимные клетки - миокардиально мезенхимная дифференциация [4]. В ходе нашего исследования о начале данного этапа свидетельствовало появление в кардиогеле подушек ствола эмбрионального сердца популяции клеток с положительной реакцией маркера a-SMA (a-SMA+). Индекс пролиферации миоцитов миокардиальной манжетки повышался на 24,0% (р<0,05) в сравнении с предыдущей стадией, но все равно его значение в сравнении с аналогичным значением кардиомиоцитов правого желудочка было достоверно сниженным (рис. 1). На 11 -й день (стадия 18 по Тейлеру) эмбриогенеза длина КСО увеличивалась на 27,2% (р<0,05), при этом длина левой подушки ствола и переднего конусного гребня значительно превышала длину противоположных эмбриональных структур КСО (рис. 2). Данный отдел сердца в течении 11-х суток достигал максимальной длины 357,6±31,1 мкм. Индекс пролиферации ядер мезенхимных клеток структурных компонентов КСО достоверно возрастал на 33,3%, кардиомиоцитов правого желудочка - на 27,5% (р<0,05). Пролиферативный индекс ядер миоцитов миокардиальной манжетки на данном сроке достоверных отличий от соответствующего показателя на предыдущей стадии не имел. На этом гестационном сроке продолжалась мио-кардиализация стволовых подушек, а именно ее манжетковый этап. В субэндо-кардиальном пространстве структурных компонентов ствола начинали появляться a-SMA+ клетки. Это свидетельствовало о начале субэндокардиального этапа мио-кардиализации. К середине 11 -х суток (стадия 19 по Тейлеру) эмбрионального развития КСО сердца начинал сокращение в длине, укорачиваясь на 28,1% (р<0,05) в сравнении с предыдущим сроком. Индекс пролиферации миоцитов миокардиальной манжетки в сравнении с аналогичным показателем кардиомиоцитов правого желудочка начал стремительно и достоверно уменьшаться, составляя значении в 2 раза меньше. Мио-кардиализация структурных компонентов КСО продолжалась. Манжетковый этап 8 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №4, 2013 г. Рис. 1. Трехмерные модели эмбрионального сердца мыши (А, В) и конусно-стволового отдела (Б, Г) на 10-й и 11 -й дни эмбриогенеза. Стрелкой указан конусно-стволовой изгиб Рис. 2. Гистологический срез стволового отдела эмбрионального сердца мыши, 10,5 день гестации. Иммуногистохимическая реакция, маркер Кі-67, доокрашивание гематоксилином Майера. А - *100; Б, В - *400. В - инверсированное изображение реакции характеризовался значительным уменьшением и истончением миоидных клеток, тогда как a-SMA+ популяция расширялась в сторону аортопульмонального септационного комплекса, преимущественно над его подковой. a-SMA+ конусная популяция расширялась с появлением миоидных комплексов при трабекулярном миокарде конусных гребней. Таким образом, инициировался трабекулярный этап миокардиализации эндокардиаль-ных структур данного отдела сердца. На 12-е сутки (стадия 20 по Тейлеру) гестации укорачивание КСО продолжалась, и его нынешняя длина составляла 369±41,2 мкм. Миокардиализация структурных компонентов ствола продолжалась и осуществлялась уже в три полноценные стадии: манжетковую, субэндокар-диальную и септационную. На этом строке, a-SMA+ клетки наблюдались среди конден-сованной мезенхимы субэндотелиального пространства новообразованных сосудов. Согласно исследованиям [4], артериализация стенок магистральных сосудов в процессе их гистогенеза проявлялась транс-дифференцировкой мезенхимы в гладкие миоциты медии крупных сосудов. В ходе нашего исследования определялось, что 9 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №4, 2013 г. начало этого гистогенетического процесса наблюдалось в конце септационного и на протяжении субэндотелиального этапов. Следовательно, нам удалось установить, что последние два этапа миокардиализации структурных компонентов ствола эмбрионального сердца можно назвать артериализа-цией стенок магистральных сосудов. Данный процесс рассматривается в ряде литературных источников либо как продолжение [6], либо как часть миокардиализации [10]. В период 12,5 сут эмбриогенеза (стадия 21 по Тейлеру) показатели длины структурных компонентов КСО продолжали стремительно падать, достоверно уменьшая общую длину КСО на 28,9% (р<0,05). Пролиферация миоцитов миокардиальной манжетки задерживалась на том же уровне. aSMA+ популяция конусных гребней расширялась в виде появления субтрабекулярного слоя миоидных клеток, которые имели меньшую интенсивность реакции и большую степень компактизации, чем подлежащий трабекулярный конусный миокард. Над субтра-бекулярным слоем определялись комплексы миоидных клеток. Артериализа-ция стенки новообразованных сосудов набирала обороты, наиболее интенсивно проявляясь на субэндотелиальном этапе. С 13 -х гестационных суток (стадия 22 по Тейлеру) длина КСО продолжала достоверно уменьшаться за счет очевидного сокращения длины стволовых подушек. Верхние 2/3 данных подушек трансформировались в интраперикардиальные части аорты и легочного ствола, а нижняя 1/3 - в зону полулунных клапанов. aSMA+ клетки бывшей стволовой части наблюдалась в составе субэндотелиальной и частично септационной фракций. aSMA+ конусная клеточная популяция расширялась в дорсо-вентральном направлении. На протяжении 14-х эмбриональных суток (стадия 23 по Тейлеру) окончательно сокращалась длина КСО отдела, за счет редукции конденсированной мезенхимной популяции путем апоптоза. aSMA+ субэн-докардиальная конусная клеточная фракция передвигалась на проводящие края обоих гребней, заполняя полностью их субэндо-кардиальное пространство. На 15-й день эмбрионального развития (стадия 24 по Тейлеру) КСО как промежуточная эмбриональная структура завершал свое существование за счет того, что участок конусных гребней полностью приближался по строению к частям стенок выхода магистральных сосудов из соответствующих желудочков. Изменение качественных особенностей гистогенетических перестроек КСО, которые влияют на показатели его длины в экспериментальных условиях, в ходе нашего исследования были опровергнуты. Количественные показатели в условиях дегидратации материнского организма также не имели достоверных отличий с соответствующими нормальными показателями. Итак, причиной уменьшения длины КСО определялась физиологическая задержка пролиферации миоцитов миокардиальной манжетки. Данная манжетка, не увеличиваясь, сдерживала удлинение КСО. В ходе исследования было установлено, что уменьшение пролиферативной активности миоцитов миокардиальной манжетки было обусловлено их активным участием в процессах миокардиализации структурных компонентов конуса и ствола. Выводы 1. Манжетковый этап миокардиализа-ции подушек ствола сменяет субэндокар-диальный на 11 -е сутки эмбрионального развития. Миокардиализация конусных гребней проходит трабекулярный и субэндокар-диальный этапы, которые начинаются на 11,5 день гестации и продолжаются два дня. 2. Артериализация стенок новообразованных магистральных сосудов проходит септационную и субэндотелиальную стадии. Являясь отдельным этапом гистогенеза КСО, артериализация следует за миокардиализацией. 3. Пролиферативный индекс ядер мио-цитов миокардиальной манжетки достоверно снижен в сравнении с соответствующим показателем ядер кардиомиоцитов правого желудочка на протяжении гистогенетических перестроек КСО эмбрионального сердца.