АНАЛИЗ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИ РАЗЛИЧНЫХ ЗОН КОРЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС

Аннотация

В работе, в эксперименте, проведенном на беспородных белых крысах-самцах, облученных однократно в дозе 1,0 Гр, анализировали морфофункциональные изменения нейроцитов новой, старой и древней коры головного мозга в течение 18 месяцев после радиационного воздействия. Полученные данные в виде регрессионных уравнений, позволяют на основании имеющихся данных о морфофункциональном состоянии нервных клеток облученного животного, рассчитывать время, прошедшее после облучения.

Полный текст

Оценка закономерностей реакции человека на различные экзогенные факторы и поиск средств профилактики, защиты и лечения - одна из основных задач современной медицины [8, 10, 11, 13]. Создавая адекватные экспериментальные модели, исследователи преследуют цель -изучение механизмов воздействия исследуемого фактора на организм человека путем экстраполяции полученных данных эксперимента, опираясь на общность симптоматики у различных видов животных и человека [4, 6, 7] и разработанные коэффициенты экстраполяции [2, 3]. Материалы и методы Эксперимент спланирован и проведен на базе Государственного научноисследовательского испытательного института военной медицины МО РФ (г. Москва). В его основу положены данные о лучевой нагрузке у военнослужащих-ликвидаторов аварии на ЧАЭС и состоянии их здоровья в ранние и отдаленные сроки пострадиационного периода. Эксперимент проведен на 100 половозрелых крысах-самцах весом 200-230 г, в возрасте 1,5-2 месяцев к началу эксперимента. Животные подвергались общему равномерному однократному гамма-облучению спектр 1,2 МЭв на установке «Хи-затрон» (Со60) в дозе и 1,0 Гр. Мощность дозы облучения составляла 50 сГр/ч. Взятие материала производилось через 1 сут, 6, 12 и 18 месяцев после воздействия. Протокол эксперимента в разделах выбора, содержания животных и выведения их из опыта был составлен в соответствии с принципами биоэтики и правилами лабораторной практики, представленных в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985) и приказе МЗ РФ №267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики». Дозиметрический контроль равномерности облучения осуществлялся клиническим дозиметром 27012, стержневая камера которого располагалась в поле облучения. Неравномерность дозового поля составила ± 15%. Материалом исследования служили участки мозга, выделяемые согласно цитоархитектоническим 28 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №3, 2014 г. картам [5, 12, 14] - вторичная моторная кора (кора верхней лобной извилины (ВЛИ), прелимбическая (кора передней лимбической области (ПЛО), цитоархи-тектонические поля СА1-СА4 гиппокампа и зубчатая фасция (ЗФ), пириформная зона древней коры (ПЗ). Фрагменты мозга фиксировали в 10%-ном растворе формалина, приготовленном на 0,2 М фосфатном буфере. Парафиновые срезы толщиной 4-5 мкм окрашивали гематоксилином Караци-эозином для обзорных целей. Для изучения цитоархитектоники микропрепараты окрашивали метиленовым синим по Нисслю [1]. В изучаемых отделах коры головного мозга с помощью программы “Видео-Тест-Морфо” (С.-Петербург) проводили измерение площадей сечения тела нейроцитов, их ядра и ядрышка. Вычисляли ядерно-клеточный, ядерно-цитоплазматический и ядрышко -ядерный индексы. Ввод изображения производился через оптическую систему микроскопа “Leika“, DMLS, с видеокамерой JVC ТК-1280Е и адаптером, подключенные к компьютеру “PENTIUM-II”. Для проведения регрессионного анализа у каждого животного учитывались морфометрические показатели для 300 нормохромных нейроцитов. Полученные данные обрабатывались с помощью программ «Microsoft Excel 2003», «Statistica 6.0» for Windows. Статистический анализ количественных переменных основывался на вычислении средней величины, дисперсии, среднего квадратичного отклонения, ошибки среднего арифметического, коэффициентов ассиметрии и эксцесса. При этом учитывали характер закона распределения параметров: в условиях нормального распределения выборки для оценки вероятности различий использовали критерий Стьюдента, в остальных случаях - непараметрический критерий Вилкоксо-на-Манни-Уитни. Объем материала, необходимого для исследования, определяли методом аккумулированных средних. Достоверными при этом считались различия с вероятностью более 0,95 (Р<0,05). Нами был выполнен множественный регрессионный анализ между шестью определенными независимыми параметрами, характеризующими строение нейроцита (табл. 1) и сроками прошедшими после воздействия радиоактивного излучения. Таблица 1 Параметры, характеризующие строение нейроцита Условное обозначение Наименование показателя a1 Площадь сечения нейрона a2 Площадь сечения ядра as Площадь сечения ядрышка a4 Ядерно-клеточный индекс a5 Ядерно-цитоплазматический индекс a6 Ядрышко-ядерный индекс Для исключения мультиколлинеарности матрицы данных перед выполнением регрессионного исследования в каждой выборке для каждого показателя был проведен анализ матрицы коэффициентов парной корреляции 6 абсолютных морфометрических показателей нейронов (ai-a6). Значения некоторых из них коррелируют между собой с коэффициентом r>0,7, то есть расцениваются статистически как одна независимая величина. Морфометрические показатели нейронов, имеющие высокий коэффициент корре ляции (r>0,7) были редуцированы. Множественный линейный регрессионный анализ выполнялся в пакете программ IBM SPSS Statistics 20.0 методом пошагового исключения. Данная методика заключается в последовательном исключении факторов с помощью t-критерия. В результате построения уравнения регрессии и оценки значимости всех коэффициентов регрессии из модели исключался тот фактор, коэффициент при котором незначим и имел наименьшее значение t-статистики по абсолютной 29 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №3, 2014 г. величине. Таким образом, получалось новое уравнение множественной регрессии, и снова проводили оценку значимости всех оставшихся коэффициентов регрессии. Процесс исключения факторов останавливался лишь на том шаге, при котором все регрессионные коэффициенты были значимы. В ходе регрессионного анализа сформированных выборок, получены следующие регрессионные уравнения с коэффициентами регрессии, статистически значимо отличные от нуля при p=0,050. После каждого уравнения в скобках указан коэффициент корреляции (R), коэффициент детерминации (R2), коэффициент Фишера (F) и уровень значимости уравнения регрессии [9]. Результаты и их обсуждение В результате проведенного исследования были получены данные, свидетельствующие о значительном снижении площади сечения нейроцита, ядра и ядрышка в первые сутки после воздействия, далее в течение всего срока наблюдения -исследуемые показатели приближаются к исходным значениям, однако к концу срока все же остаются ниже контрольного уровня. Следует отметить, что, несмотря на сходную динамику всех исследуемых нейроморфологических параметров в старой и древней зонах коры головного мозга к 18 месяцам после воздействия площади сечения нейроцита, ядра и ядрышка возвращаются к контролю или превышают исходный уровень. Используя массив полученных характеристик нормохромных нейроцитов в филогенетически различных зонах коры головного мозга крыс, проведен регрессионный анализ с целью установления времени, прошедшего после сеанса облучения. Для клеток верхней лобной извилины: хВЛИ=6549,263-23073,808ха4-19885,256ха6; (R=0,991, R2=0,983, F=6320,214, при p=0,000); Для нейронов передней лимбической области: хПЛО=3019,975-12543,889ха4; (R=0,974, R2=0,948, F=3994,051, при p=0,000); Для нейроцитов пириформной зоны древней коры: хДК=6734,480+12,316ха2-38382,045ха5; (R=0,999, R2=0,999, F=161555,968, при p=0,000); Для пирамидных клеток поля СА1 гиппокампа: xGA1=-25867,205+3808,413xa3+5947,680xa4+27854xa5; (R=0,999, R2=0,999, F=108725,868, при p=0,000); Для пирамидных клеток поля СА2 гиппокампа: xCA2=784,483+47,593xa1+36,220xa2-16108,331xa5-98,302xa6; (R=0,999, R2=0,999, F=3559458 1,51,при p=0,000); Для пирамидных клеток поля СА3 гиппокампа: xcA3=-10093,915+232,619xa2-427,988xa4-314,462xa5; (R=0,992, R2=0,985, F=4855,678, при p=0,000); Для пирамидных клеток поля СА4 гиппокампа: XcA4=-6424,106-9,858xa2+2579,453xa3; (R=0,983, R2=0,966, F=3185,017, при p=0,000); Для гранулярных клеток зубчатой фасции: X3®=-2459,512+31,028xa1+13,541xa3-1996,030xa5-215381,191xa6; (R=0,999, R2=0,999, F=656244,788, при p=0,000). Регрессионный анализ позволяет рассчитать с известной долей допущений [2, 3] время, прошедшее после воздействия заданной дозы ионизирующего излучения, по известным морфофункциональным характеристикам нейроцитов. Соответственно, возможны прогнозирование и корректировка предполагаемых изменений в различных в филогенетическом отношении зонах коры головного мозга. Заключение Таким образом, регрессионный анализ, проведенный по результатам эксперимента, позволил обосновать зависимость морфофункциональных изменений, развивающихся в нейроцитах филогенетически различных отделов мозга от времени, прошедшего после облучения.