ESTIMATION OF DNA FRAGMENTATION, ACONITASE ACTIVITY AND CITRATE LEVEL UNDER TYPE 2 DIABETES AT RAT AND INTRODUCTION OF MELATONIN

Full Text

В настоящее время всё возрастающее значение среди неинфекционных заболеваний приобретает сахарный диабет [1]. Хроническая гипергликемия, являющаяся основным и объективным признаком наличия этого заболевания, тесно связана с развитием оксидативного стресса [15], который вызывает дисфункцию эндотелия и, таким образом, играет ключевую патогенетическую роль в развитии острых осложнений данной эндокринопатии. Известно, что ионы металлов пере- т- 2+ менной валентности, в частности Fe2+, способствуют образованию гидроксильного радикала в реакции Фентона и Хабера-Вайса и усиливают свободнорадикальное окисление (СО) биомолекул. В качестве хелатора ионов железа может выступать цитрат [14]. Благодаря наличию в его структуре трех карбоксильных групп цитрат может эффективно связывать ионы металлов. Реакцию превращения цитрата в изоцитрат катализирует аконитатгидратаза (АГ, КФ 4.2.1.3). Молекула данного фермента легко разрушается активными формами кислорода (АФК), что позволяет рассматривать данный фермент как критиче скую мишень действия свободных радикалов (СР) [10]. Уменьшая выраженность окислительного стресса с помощью анти-оксидантной терапии, теоретически можно не только замедлить прогрессирование диабетических сосудистых осложнений, но и снизить резистентность клеток к инсулину, способствуя тем самым лучшей компенсации нарушенного углеводного обмена [5]. Имеются данные, что мелатонин может выступать как перехватчик гидроксильного радикала, синглетного кислорода, оксида азота [3]. Кроме этого, гормон обладает способностью непосредственно связывать ионы металлов с переменной валентностью, которые проявляют в организме прооксидантное действие [4]. Поскольку активные метаболиты кислорода также способны повреждать генетический аппарат клеток путем формирования разрывов ДНК, ее деградации и потери клеткой части генетического материала, то представляет интерес исследование протекторного действия мелатонина, обладающего липофильными свойствами и способного беспрепятственно проникать в ядро. В прямых экспериментах 21 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №3, 2012 г. на культуре клеток и в опытах на животных показано, что данный гормон проявляет антиапоптотические свойства [12]. Цель исследования - изучить влияние мелатонина на степень фрагментации ДНК, активность АГ и уровень цитрата в гепатоцитах печени в эксперименте на крысах с СД2 типа. Материалы и методы В качестве объекта исследования использовали белых крыс-самцов (Rattus rattus L.) массой 150-200 г. СД2 индуцировали внутримышечным введением прота-мин-сульфата в течение 3-х недель в дозе 10 мг/кг массы тела животного в объеме 0,5 мл 0,85% раствора NaCl, 3 раза в сутки [8]. Животных умерщвляли под наркозом. Печень извлекали после перфузирования ледяным раствором натрия хлорида со скоростью 5 мл/мин в течение 5 мин. Навеску печени крысы гомогенизировали в 4-кратном объеме охлажденной среды выделения следующего состава: 0,1 М трис-НО-буфер (рН 7,8), содержащий 1 мМ ЭДТА, 1% ß-меркаптоэтанол. Гомогенат центрифугировали при 10000 g в течение 12 мин. Полученный супернатант использовали для исследования. Венозную кровь выдерживали 0,5 часа при 37 0С, затем центрифугировали при 2500g в течение 15 мин. Полученную сыворотку использовали для дальнейшего исследования. Животные были разделены на 3 экспериментальные группы: 1 -ую группу (контроль; n=12) составляли животные, содержащиеся в условиях стандартного режима вивария; во 2-й группе (n=10) у крыс индуцировали сахарный диабет 2-го типа при помощи внутримышечного введения протамин-сульфата в дозе 10 мг/кг по [8]; в 3-й группе (n=10) животным с СД2 внутрибрюшинно вводили мелатонин в дозе 2 мг/кг массы тела в объеме 1 мл 0,85% раствора NaCl на 15 сутки после начала индуцирования СД2, троекратно с интервалом в один день. На 21-е сутки после начала эксперимента осуществляли забор биоматериала для исследований. Фрагментацию ДНК, выделенной фенольно-хлороформным методом [7], выяв ляли путем проведения электрофореза образца ДНК в агарозном геле с использованием буфера трис-ацетат-ЭДТА (ТАБ). Активность ЛГ определяли спектрофотометрически на спектрофотометре Hitachi U1900 с программным обеспечением при 233 нм. О скорости дегидратации цитрата в ходе АГ реакции судили по возрастанию оптической плотности в результате образования двойной связи в молекуле цис-аконитата. Для oпределения активности АГ использовали среду следующего состава: 50 мМ трис-НО-буфер, pН 7,8, содержащий 0,15 мМ цитрат. Количество цитрата определяли по методу Нательсона [2]. Данные обрабатывали с использованием t-критерия Стьюдента, различия считали достоверными при p<0,05. Результаты и их обсуждение ДНК, выделенная из печени крыс с СД2, была фрагментирована, как видно на рис.1, по сравнению с ДНК контрольных проб. По мнению ряда исследователей, подобные фрагменты возникают при действии апоптоз-специфических нуклеаз [11]. Введение мелатонина животным с СД2 приводило к снижению степени фрагментации ДНК (рис.1), что может быть свидетельством антиапоптотическо-го действия мелатонина. Снижение интенсивности апоптоза в гепатоцитах, очевидно, было взаимосвязано с уменьшением скорости процессов СО. Известно, что одной из чувствительных мишеней действия СР является АГ, выполняющая основную роль в регуляции аккумуляции цитрата [10]. Показано, что в условиях активации СО происходит угнетение активности фермента и накопление цитрата, являющегося низкомолекулярным антиоксидантом вследствие хелатирующих его свойств по отношению к ионам Fe2+ [9]. Ионы Fe2+, как известно, обладают проок-сидантной активностью [6]. Результаты проведенных исследований показали, что при СД2 у крыс происходит увеличение содержания цитрата в 2,3 раза в печени и в 2,7 раза в сыворотке крови (рис. 2) по сравнению с контрольными значениями. 22 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №3, 2012 г. Рис. 1. Фрагментация ДНК в печени крыс: 1 - маркеры; 2 - контрольная группа; 3 - при сахарном диабете 2-го типа, 4 - при введении мелатонина животным с патологией (СД2) Рис. 2. Концентрация цитрата в печени и сыворотке крови крыс: 1 - контрольная группа; 2 - при сахарном диабете 2-го типа, 3 - при введении мелатонина животным с патологией (СД2) Полученные результаты согласуются с данными литературы о том, что при патологических состояниях, сопряженных с оксидативным стрессом, происходит нарушение утилизации цитрата [13]. При этом наблюдалось снижение удельной активности АГ в печени крыс с СД2 в 1,9 раза (рис.3 (I)), в сыворотке крови в 2,8 раза (рис.3(11)) относительно контроля. 23 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №3, 2012 г. Г руппы жив отных Рис. 3. Активность аконитатгидратазы (I) - в печени крыс, (II) - в сыворотке крови крыс 1 - контрольная группа животных; 2 - при сахарном диабете 2-го типа; 3 - при введении мелатонина животным с патологией Известно, что активность АГ может служить маркером степени развития ок-сидативного стресса, так как под действием АФК фермент теряет активность вследствие окислительной модификации активного центра, связанной с высвобождением атома железа из железо-серного кластера [10]. При введении мелатонина крысам с СД2 концентрация цитрата снижалась в печени и сыворотке крови крыс соответственно в 1,5 и 1,8 раза по сравнению с животными второй группы (рис.2). Наряду с этим, при введении мелатонина было вы явлено увеличение удельной активности АГ в печени и сыворотке крови по сравнению со значениями при патологии (СД2). Так, удельная активность АГ при действии мелатонина возрастала в печени и сыворотке крови крыс соответственно в 1,5 и 2,1 раза (рис.3(1, II)). Модификации активности АГ, выраженной в Е/г сырой массы печени и Е/мл сыворотки, демонстрировали ту же тенденцию, что и удельная активность фермента (рис.3(!, II)). Изменение исследуемых параметров в сторону контрольных значений при введении мелатонина животным с СД2, очевидно, свиде 24 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №3, 2012 г. тельствует о снижении уровня окислительного стресса, что ведет к реконструкции активного центра АГ и утилизации цитрата в катализируемой АГ реакции. Таким образом, мелатонин-опосредованное восстановление активности АГ, выступающей в качестве критической мишени действия СР при патологии и, как следствие, нормализация концентрации цитрата, а также снижение степени фрагментации ДНК, могут указывать на способность мелатонина оказывать позитивное регулирующее воздействие на свободнорадикальный гомеостаз, что приводит к уменьшению степени проявления оксидативного стресса при СД2. Выводы 1. Развитие сахарного диабета 2 типа у крыс сопровождалось фрагментацией ДНК, снижением активности аконитат-гидратазы и, как следствие, увеличением уровня цитрата как в печени, так и в сыворотке крови. 2. Введение мелатонина животным с сахарным диабетом типа 2 сопровождалось нормолизацией исследуемых параметров, что, вероятно, было обусловлено антиоксидантными свойствами данного гормона.

References

Supplementary files