PASSIVE AVOIDANCE BEHAVIOR AFTER STRESS EXPOSURE OF RATS IMMUNIZED BY GLUTAMATE-BSA CONJUGATE

Full Text

Исследования последних десятилетий показывают, что иммунные факторы вовлекаются в механизмы регуляции физиологических функций и поведения наряду с процессами нервной и гуморальной природы [6, 7]. Новые перспективные пути коррекции функций мозга и поведения открывают методы иммунизации конью-гатами биологически активных соединений с белками [2]. По данным [9] иммунизация мышей коньюгатом серотонина с бычьим сывороточным альбумином (БСА) сопровождается удлинением времени нахождения в светлом отсеке при повторном предъявлении теста «Условнорефлекторное пассивное избегание» (УР-ПИ). Направленная модуляция церебральных нейрохимических механизмов поведения возможна при введении конью-гатов нейромедиаторов с белками, вызывающих повышение в крови уровня антител к нейромедиаторам [3, 4]. При действии антител к глутамату обнаружено изменение болевой чувствительности [5, 9]. Учитывая важную роль глутаматергиче-ских процессов в мозговых механизмах поведения [12] актуальным является изучение поведенческих реакций при иммунизации коньюгатом глутамата с БСА. Известно, что уровень двигательной и исследовательской активности крыс в тесте «Открытое поле» (ОП) отражает прогностическую устойчивость животных к нарушениям, вызванным эмоциональным стрессом [8, 10]. При этом особи с высокой поведенческой активностью проявляют в условиях однотипных стрессорных воздействий признаки устойчивых к повреждающему действию стресса, а пассивные - предрасположенных особей. В связи с этим, цель данной работы - в исследовании поведения активных и пассивных крыс в тесте УРПИ на фоне иммунизации коньюгатом глутамата с БСА. Материалы и методы Опыты проведены на 48 крысах самцах Вистар. Эксперименты проведены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных живот- 43 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, № 2, 2013 г. ных», утвержденных в ФГБУ «НИИ нормальной физиологии имени П.К. Анохина» РАМН, которые соответствуют требованиям Всемирного общества защиты животных (WSPA) и Европейской конвенции по защите экспериментальных животных. После семисуточной адаптации к условиям вивария исследовали поведение крыс в тесте ОП. Время тестирования животных составляло 3 минуты. По значениям параметров поведения крыс в тесте ОП был рассчитан суммарный показатель активности (СПА) животных, представлявший собой сумму центральных и периферических квадратов, центральных и периферических стоек, а также исследованных объектов. По величине СПА каждая крыса была отнесена в группу активных и пассивных животных. Были отобраны 24 крысы с высокой и 24 крысы с низкой поведенческой активностью. В группу пассивных были включены крысы, СПА которых составил 76,44±2,03; в группу активных - особи, среднее значение СПА которых равнялось 134,23±1,93. Активные и пассивные по поведению в ОП крысы были разделены на две группы по 12 животных в каждой. Активных и пассивных крыс первой группы иммунизировали коньюгатом глутамата с БСА. Конъюгат глу-тамата с БСА синтезировали с использованием глутарового альдегида по методике [11]. Крыс иммунизировали конъюгатом глутама-та трижды возрастающими дозами по схеме: первая иммунизация подкожно в 2-3 точки области спины конъюгатом в дозе 2 мг/кг с полным адьювантом Фрейнда в объеме 0,5 мл (0,25 мл раствора конъюгата + 0,25 мл адъюванта); вторая иммунизация через две недели после первой в дозе 5 мг/кг с неполным адъювантом Фрейнда подкожно; третья иммунизация - через одну неделю после второй иммунизации внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг в 0,5 мл физиологического раствора. Опыты проводили через четыре недели после начала иммунизации. По двенадцать активных и пассивных по поведению в ОП крыс составили контрольную, неиммунизированную группу. Этим животным вводили бычий сывороточный альбумин и адъювант Фрейнда по однотипной с иммунизацией схеме и в одинаковых дозах. Тест УРПИ представлял собой камеру, состоящую из 2-х отсеков: освещенного и затемненного с электропроводящим полом. Крыс помещали в освещенный отсек и измеряли латентный период перехода в темный отсек. После перехода в темный отсек животным предъявляли электрокожное раздражение. Второе тестирование проводили через 72 часа после первого тестирования. При втором тестировании УРПИ оценивали латентный период перехода в темный отсек. Продолжительность второго тестирования составляла 180 секунд. За два часа до второго предъявления теста УРПИ по 6 поведенчески активных и пассивных крыс в группах иммунизированных и неиммунизированных животных подвергали часовому стрессорному воздействию. Стрессорную нагрузку моделировали фиксацией крыс на платформе за лапы с одновременным стохастическим электрокожным раздражением силой 0,25 мА, частотой 50 Гц, с продолжительностью 1 минута и интервалами от 3 до 8 минут. В группы нестрессированных перед вторым предъявлением теста УРПИ животных вошли также по 6 иммунизированных и неиммунизированных крыс с различной поведенческой активностью. После окончания опытов крыс умерщвляли путем декапитации, при этом собирали кровь для исследования содержания в ней антител к глутамату. Уровень антител определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием считывающего устройства «Mini-Reader» (Dynateck). В качестве тест антигена использовали коньюгат глутама-та на гетерологическом белковом носителе гамма глобулине лошади, синтезированном по описанной ранее методике [11]. Результаты опытов представлены в виде средних величин ± стандартная ошибка среднего. Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Statistica 8.0 (StatSoft, Inc). Достоверность различий оценивали с помощью дисперсионого анализа и непараметрических критериев Манна-Уитни в 44 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, № 2, 2013 г. случае сравнения зависимых совокупностей или критерия Уилкоксона при сравнении независимых групп. Результаты и их обсуждение Как показали проведенные опыты, антитела в крови иммунизированных коньюгатом глутамата с БСА крыс были выявлены в титрах 1:512 до 1:1024. Уровень содержания антител к глутамату не различался у поведенчески активных и пассивных животных. Результаты опытов по исследованию поведения в тесте УРПИ иммунизированных коньюгатом глутамата с БСА активных крыс представлены на рисунке 1. Как показали проведенные опыты, латентный период перехода в темный отсек при втором предъявлении теста УРПИ достоверно удлинялся по сравнению с его длительностью при первом тестировании УР-ПИ у неиммунизированных активных крыс. У активных иммунизированных крыс, которых за два часа до повторного предъявления теста УРПИ подвергали часовой стрессор-ной нагрузке, латентный период перехода в темный отсек при втором предъявлении теста УРПИ был достоверно короче длительности перехода неиммунизированных поведенчески активных крыс при однотипном тестировании УРПИ (р<0,05). Результаты опытов по исследованию поведения в тесте УРПИ иммунизированных коньюгатом глутамата с БСА пассивных крыс представлены на рисунке 2. Результаты проведенных опытов показали, что латентный период перехода в темный отсек при втором предъявлении теста УРПИ достоверно удлинялся у поведенчески пассивных неиммунизированных крыс при повторном предъявлении теста. У поведенчески пассивных крыс, иммунизированных коньюгатом глутамата с БСА, было также выявлено удлинение латентного периода перехода в темный отсек при повторном предъявлении теста УРПИ. Таким образом, повышение в крови уровня антител к глутамату в результате иммунизации крыс коньюгатом глутамата с БСА сопровождается у поведенчески активных крыс укорочением латентного периода перехода в темный отсек при по вторном предъявлении теста УРПИ после стрессорной нагрузки. При переходе в темный отсек из светлого крысы удовлетворяют биологическую мотивацию защиты в темном, замкнутом пространстве от аверсивных раздражителей яркого света и открытого пространства. Можно предположить, что латентный период перехода в темный отсек при первом предъявлении УРПИ отражает выраженность мотивации избегания крысами открытого пространства и яркого света - врожденного норного поведения грызунов. Также на длительность латентного периода перехода в темный отсек может влиять исследовательская мотивация животного. При предъявлении крысе электрокожного раздражения в темном отсеке у животного формируется реакция избегания темного отсека. Мы полагаем, что при проведении через 72 часа второго предъявления теста УРПИ поведение крысы строится на основе взаимодействия двух мотиваций: с одной стороны - избегания открытого пространства и яркого освещения, и с другой стороны - предвидения болевого раздражения в темном отсеке. При анализе предвидения болевого воздействия необходимо учитывать процессы сохранения и воспроизведения памятного следа об электро-кожном раздражении, имевшем место в темном отсеке при первом предъявлении теста УРПИ. Также на оценку значимости электрокожного раздражения в аппарате предвидения [1] может оказать влияние величина порога болевой чувствительности у крыс. Таким образом, укорочение длительности латентного периода перехода в темный отсек при повторном предъявлении теста УРПИ может быть вызвано различными причинами: усилением избегания крысами аверсивных раздражителей в светлом отсеке камеры, нарушением формирования и воспроизведения памятного следа об электрокожном раздражении, снижением порога болевой чувствительности, ослаблением мотивации избегания электрокожного раздражения. В наших опытах показано, что иммунизация активных крыс коньюгатом 45 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, № 2, 2013 г. 200 S 160 ч: О EL 120 (D С £ 80 II (D k 40 0 151,32 168,67 * * 42,50±12,24 151,32±28,68 168,67±11,33 144,67 61,56±23,70 144,67± 15,50 24,75±14,54 Рис. 1. Латентные периоды переходов в темный отсек в тесте УРПИ у поведенчески активных крыс, неимму-низированных (1) и иммунизированных коньюгатом ГЛУ с БСА (2). Светлые столбики - первое предъявление теста УРПИ; столбики с косой штриховкой - повторное предъявление теста УРПИ без предшествующего стрессорного воздействия; столбики с поперечной штриховкой - повторное предъявление теста УРПИ после стрессорного воздействия. * - p<0,05 по сравнению с латентным периодом перехода при первом предъявлении теста УРПИ; # - p<0,05 по сравнению с латентным периодом перехода при повторном предъявлении теста УРПИ после стрессорного воздействия у поведенчески активных неиммунизированных животных. 200 173,33 160 ч: о . 120 80 га 40 138,25 * * 151,25 136,33 * 62,90±22,43 138,25±37,34 173,33±5,17 65,60±22,30 151,25±25,71 136,33±33,82 Рис. 2. Латентные периоды переходов в темный отсек в тесте УРПИ у поведенчески пассивных крыс, неимму-низированных (1) и иммунизированных коньюгатом ГЛУ с БСА (2). Светлые столбики - первое предъявление теста УРПИ; столбики с косой штриховкой - повторное предъявление теста УРПИ без предшествующего стрессорного воздействия; столбики с поперечной штриховкой - повторное предъявление теста УРПИ после стрессорного воздействия. * - p<0,05 по сравнению с латентным периодом перехода при первом предъявлении теста УРПИ. 0 46 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, № 2, 2013 г. глутамата с БСА сопровождается укорочением латентного периода перехода в темный отсек при повторном предъявлении теста УРПИ после стрессорной нагрузки. Как уже отмечено, в основе укорочения латентного периода при этом могут лежать различные причины. Их уточнение и изучение представляет предмет дальнейших исследований. Однако на основе полученных данных можно заключить, что иммунизация коньюгатом глутамата с БСА сопровождается у поведенчески активных крыс изменением процессов организации поведения избегания электрокожного воздействия после стрес-сорной нагрузки. Выводы Проведенные исследования показали, что иммунизация коньюгатом глутамата с БСА, приводящая к возрастанию уровня антител к глутамату в крови, сопровождается у поведенчески активных крыс снижением избегания электрокожного воздействия в тесте УРПИ после стрессорной нагрузки. Это может отражать изменение процессов организации поведения избегания электро-кожного воздействия после стрессорной нагрузки на фоне иммунизации коньюгатом глутамата с БСА.

References

Supplementary files