Biomodeling of mixed origin fatty liver disease

Tatiana V. Brus; Брус Татьяна Викторовна; Andrei G. Vasiliev; Васильев Андрей Глебович; Aleftina A. Kravcova; Кравцова Алефтина Алексеевна; Anna V. Vasilieva; Васильева Анна Валентиновна; Yurii S. Brus; Брус Юрий Сергеевич; Anastasia V. Bannova; Баннова Анастасия Викторовна

doi:10.17816/PED625940

Biomodeling of mixed origin fatty liver disease

Authors: Brus T.V.¹, Vasiliev A.G.¹, Kravcova A.A.¹, Vasilieva A.V.¹, Brus Y.S.¹, Bannova A.V.²
Affiliations:
1. Saint Petersburg State Pediatric Medical University
2. V.I. Vernadsky Crimean Federal University
Issue: Vol 14, No 5 (2023)
Pages: 25-31
Section: Original studies
URL: https://journals.eco-vector.com/pediatr/article/view/625940
DOI: https://doi.org/10.17816/PED625940
ID: 625940

Cite item

Full Text

Open Access
Restricted Access

Access granted
Restricted Access

Subscription or Fee Access

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

BACKGROUND: The main examples of liver pathology of metabolic and toxic origin are non-alcoholic, alcoholic fatty liver disease and fatty degeneration of mixed origin. Currently, due to the lack of a clear understanding of the causes and pathogenesis of hepatopathy of non-infectious origin, there are no effective methods for the prevention and treatment of these conditions. A key role in studying the etiology and mechanisms of pathogenesis is played by the search for adequate experimental models of liver failure.

AIM: To develop, test and evaluate an experimental model of mixed fatty liver disease.

MATERIALS AND METHODS: The study was conducted on 30 male albino gray Wistar rats. Experimental rats, weighing 180–200 grams at the time of inclusion in the experiment, received granulated rodent food weighing 20 grams daily for 30 days, to which 6 g of crystalline fructose was introduced (at the rate of 30% of the total diet), and instead of drinking 10% ethyl alcohol solution was given freely available in the drinking bowl.

RESULTS: In experimental group, there was a statistically significant increase in the level of aspartate aminotransferase, alanylaminotransferase, and alkaline phosphatase, which confirms the development of cytolytic and cholestatic syndromes. Autopsy liver specimens showed a histological picture of fatty degeneration of hepatocytes.

CONCLUSIONS: To achieve this goal, a method was developed for modeling fatty liver of mixed origin. A high-carbohydrate and ethanol-rich diet led to the rapid development of pathological processes in the liver. The study demonstrated the feasibility of a detailed morphological study of the liver, taking into account medical history, laboratory indicators of cytolytic and cholestatic syndromes for the differential diagnosis of fatty liver of various etiologies.

Keywords

fatty liver disease, biomodelling, rats, steatosis, steatohepatitis, alcoholic liver disease

Full Text

АКТУАЛЬНОСТЬ

Важнейшая задача здравоохранения на современном этапе — разработка и осуществление комплексных научно-обоснованных программ по профилактике и лечению болезней детского и взрослого населения. Одним из приоритетных направлений современной медицины, объединяющим интересы различных специалистов (терапевтов, кардиологов, гастроэнтерологов, эндокринологов), является изучение патогенеза и клинических проявлений жировой дистрофии печени, имеющей широкую распространенность и безусловную социальную значимость [1, 6, 7].

В настоящее время термином «жировая дистрофия печени» (ЖДП) обозначают гетерогенную группу патологических изменений печени, характеризующихся жировой дистрофией гепатоцитов или воспалительной инфильтрацией на фоне жировой дистрофии гепатоцитов. Выделяют следующие стадии ЖДП: стеатоз печени (СП), стеатогепатит (СГ) и цирроз печени.

Основным этиологическим фактором развития СП и СГ остается алкоголь, роль которого прослеживается у 46–65 % пациентов. Накоплены убедительные данные, свидетельствующие, что ожирение, инсулинорезистентность также представляют собой факторы прогрессирования СП и СГ алкогольной и неалкогольной этиологии. Ожирению в развитии стеатогепатитов отводят около 76 % [18]. Одновременное влияние нескольких факторов, таких как алкоголь и ожирение, приводит к незамедлительному развитию СП и СГ у 95 % пациентов [19]. В связи с этим сегодня алкоголь, ожирение и инсулинорезистентность рассматривают как взаимодополняющие факторы поражения печени смешанного генеза [8, 9] или смешанной жировой дистрофии печени (СЖДП) [2, 3].

Особое внимание уделяется метаболическому синдрому, олицетворяющему в настоящее время одну из наиболее приоритетных и социально-значимых проблем как терапии, так и педиатрии [11]. Это обусловлено, в первую очередь, высокой распространенностью и прогрессирующим течением данного заболевания. Ранние осложнения проявляются симптомокомплексом, в который входят задержка темпов физического и полового развития и хроническое нарушение функции печени с формированием ее жировой дистрофии [5, 15].

Биомоделирование дает исследователю практически неограниченные возможности изучения причин болезни, ввиду, в том числе, заведомо известной прямой связи между действующим причинным фактором и развивающейся патологией [4, 13, 16]; в результате становится возможным применить строго контролируемую совокупность воздействующих на организм факторов, в том числе и патогенных, что невозможно осуществить в клинической практике.

Цель данного исследования — разработать, опробовать и оценить экспериментальную модель жировой дистрофии печени смешанного происхождения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выбор объекта исследования — крыс линии Wistar — неслучаен, он определен рядом факторов: генетической однородностью, что проявляется постоянством реакций на воздействие физических, химических, стрессорных влияний, а также спецификой морфологических и биохимических показателей и определенным уровнем сходства с таковыми у человека.

Исследование проведено на 30 самцах альбиносах серых крыс Wistar, массой тела на момент включения в исследование 220–240 г, на базе научно-исследовательской лаборатории кафедры патологической физиологии с курсом иммунопатологии ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Сформировано две группы животных:

«Контроль» (n = 15) — здоровые, интактные крысы, у которых производили исследование параметров метаболизма для расчета фоновых, референсных значений («нормальные показатели»).
«СЖДП» (n = 15) — крысы, которые на протяжении всего эксперимента в качестве корма получали брикеты, содержащие пищевые компоненты в следующих соотношениях (по массе): 31 % — белок, 15 % — животный жир, 30 % — фруктоза, 13 % — целлюлоза, 5 % — минеральные вещества, 1 % — витамины, и вместо питьевой воды 10 % раствор этанола [2].

Подопытные крысы, массой тела на момент включения в эксперимент 180–200 г, в течение 30 дней ежесуточно получали 20 г гранулированного корма для грызунов, в который вводили 6 г кристаллической фруктозы (из расчета 30 % общего рациона), а вместо питьевой воды в свободном доступе в поилке получали 10 % раствор этилового спирта. Режим двигательной активности животных был не ограничен.

С целью оценки метаболических нарушений у экспериментальных животных оценивали: биохимические показатели (концентрацию общего билирубина и прямой его фракции, активность ферментов щелочной фосфатазы, аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы, уровень общего холестерина и триглицеридов). Для подтверждения развития жировой дистрофии гистологическое исследование проводилось методом световой микроскопии, окраска гематоксилином и эозином, увеличение ×40.

Статистический анализ выполнен с помощью программ GraphPadPrism 8. Полученные в ходе работы данные проверены на нормальность распределения. Тип распределения определялся критерием Колмогорова – Смирнова, Шапиро – Уилка. Для сравнения контрольной и экспериментальной групп использовали однофакторный дисперсионный анализ ANOVA, так как выборка соответствует закону нормального распределения. Различия считали статистически значимыми при значении р < 0,05. Для представления полученных данных использовали такие показатели описательной статистики, как среднеарифметическое значение и ошибка среднего. Полноценный и качественный статистический анализ позволил минимизировать количество лабораторных животных в эксперименте.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Летальности в группах животных выявлено не было. В группе СЖДП произошло увеличение массы тела животных на 75,5 ± 2,1 г и массы печени, которая составила 12,7 ± 2,3 г, что на 48,5 % больше, чем в контроле (p < 0,05).

В экспериментальной группе СЖДП отмечалось повышение уровня внутриклеточных ферментов: аспартатаминотрансферазы по сравнению с контролем (127,6 ± 8,8 против 101,4 ± 6,5 Ед/л; p < 0,05), аланинаминотрансферазы по сравнению с контролем (39,6 ± 1,5 против 33,3 ± 2,9 Ед/л; p < 0,05). О развившемся синдроме холестаза свидетельствует достоверное повышение уровня щелочной фосфатазы по сравнению с контролем (28,9 ± 2,3 против 18,2 ± 1,3 Ед/л; р = 0,0005). Регистрировалось также достоверное повышение уровня глюкозы по сравнению с контролем (9,4 ± 1 против 5,0 ± 0,4 ммоль/л; р < 0,0001) (рис. 1).

Рис. 1. Изменение биохимических показателей в экспериментальной группе. *Достоверные отличия (р < 0,05). СЖДП — смешанная жировая дистрофия печени

У животных группы СЖДП на гистологических препаратах печени зарегистрировано значимое изменение балочной структуры (рис. 2). Стеатоз смешанного типа (мелко-крупнокапельное ожирение) следует расценивать как мелкокапельный, так как оба эти варианта прогностически менее благоприятны по сравнению с крупнокапельным. Воспалительный инфильтрат внутри долек содержит нейтрофилы, лимфоциты и гистиоциты.

Рис. 2. Жировая дистрофия печени смешанного генеза. Нарушение балочной структуры (биоптат печени, окраска гематоксилином и эозином, ×40)

ОБСУЖДЕНИЕ

Диеты западного стиля, содержащие большое количество жира, фруктозы (или сахарозы) и высокий уровень холестерина широко использовались для создания моделей ЖДП у крыс, поскольку такие диетические особенности были связаны с развитием данной патологии у людей и могут вызывать не только СГ, но также ожирение и инсулинорезистентность [10, 12]. Такие крысиные модели не идеальны, поскольку диетическое питание дорогостоящее и требует увеличения длительности эксперимента.

Этанол традиционно использовался для индуцирования повреждения печени и фиброза у крыс. В этом исследовании мы использовали этанол в качестве «ускорителя» СГ. Таким образом, этанол и западная диета проявляют синергетические эффекты для ускорения формирования СГ [14, 17]. Как и ожидалось, этанол усугубил СП, дольковое воспаление и баллонную дистрофию гепатоцитов, что соответствует аналогичным изменениям у пациентов-людей.

Сочетание двух основных факторов развития жировой болезни печени у человека — гиперкалорийное питание и употребление алкоголя при ежесуточном приеме — позволяют воспроизвести модель в наиболее короткие сроки — 30 дней, при отсутствии случаев летальности в экспериментальных группах. Это минимальный срок, за который происходит развитие жировой болезни печени у крыс.

На лабораторных крысах была разработана модель, которая повторяет гистологическую картину ЖДП. Функциональные пути метаболических нарушений в этой модели очень похожи на таковые при заболевании у человека. Простота, скорость и воспроизводимость этой модели делают ее идеальной для изучения патогенеза заболеваний и тестирования новых методов лечения.

ВЫВОДЫ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Предложенный способ моделирования СЖДП отражает наиболее важные этиологические факторы и механизмы формирования патологии печени, позволяет сократить сроки эксперимента и дает 100 % воспроизводимость у подопытных животных. Он не сложен в техническом воспроизведении и создает условия для проведения оригинальных и имеющих важное практическое значение для гепатологии и экспериментальной медицины работ.
Предложенная крысиная модель СЖДП демонстрирует быстрое прогрессирование СГ и имитирует гистологические и биохимические особенности человеческого СГ, предполагая, что она станет полезным экспериментальным инструментом для доклинического тестирования фармакологических препаратов.

Разработанная в ходе исследования модель ЖДП может быть использована в дальнейших фундаментальных исследованиях по изучению патогенеза этой патологии и служить теоретическим обоснованием целесообразности фармакологической коррекции у подопытных животных, которое в последствии возможно экстраполировать на человека.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Этический комитет. Протокол исследования был одобрен локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Минздрава России (протокол № 09/04 от 11.02.2022).

ADDITIONAL INFORMATION

Authors’ contribution. Thereby, all authors made a substantial contribution to the conception of the study, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the article, final approval of the version to be published, and agree to be accountable for all aspects of the study.

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Ethics approval. The present study protocol was approved by the local of St. Petersburg State Pediatric Medical University of the Russian Ministry of Health (Protocol No. 09/04, 2022 Feb 11).

About the authors

Tatiana V. Brus

Saint Petersburg State Pediatric Medical University

Author for correspondence.
Email: bant.90@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7468-8563
SPIN-code: 9597-4953

MD, PhD, Associate Professor, Department of Pathological Physiology with the course of Immunopathology