Biomodeling of mixed origin fatty liver disease
- Authors: Brus T.V.1, Vasiliev A.G.1, Kravcova A.A.1, Vasilieva A.V.1, Brus Y.S.1, Bannova A.V.2
-
Affiliations:
- Saint Petersburg State Pediatric Medical University
- V.I. Vernadsky Crimean Federal University
- Issue: Vol 14, No 5 (2023)
- Pages: 25-31
- Section: Original studies
- URL: https://journals.eco-vector.com/pediatr/article/view/625940
- DOI: https://doi.org/10.17816/PED625940
- ID: 625940
Cite item
Abstract
BACKGROUND: The main examples of liver pathology of metabolic and toxic origin are non-alcoholic, alcoholic fatty liver disease and fatty degeneration of mixed origin. Currently, due to the lack of a clear understanding of the causes and pathogenesis of hepatopathy of non-infectious origin, there are no effective methods for the prevention and treatment of these conditions. A key role in studying the etiology and mechanisms of pathogenesis is played by the search for adequate experimental models of liver failure.
AIM: To develop, test and evaluate an experimental model of mixed fatty liver disease.
MATERIALS AND METHODS: The study was conducted on 30 male albino gray Wistar rats. Experimental rats, weighing 180–200 grams at the time of inclusion in the experiment, received granulated rodent food weighing 20 grams daily for 30 days, to which 6 g of crystalline fructose was introduced (at the rate of 30% of the total diet), and instead of drinking 10% ethyl alcohol solution was given freely available in the drinking bowl.
RESULTS: In experimental group, there was a statistically significant increase in the level of aspartate aminotransferase, alanylaminotransferase, and alkaline phosphatase, which confirms the development of cytolytic and cholestatic syndromes. Autopsy liver specimens showed a histological picture of fatty degeneration of hepatocytes.
CONCLUSIONS: To achieve this goal, a method was developed for modeling fatty liver of mixed origin. A high-carbohydrate and ethanol-rich diet led to the rapid development of pathological processes in the liver. The study demonstrated the feasibility of a detailed morphological study of the liver, taking into account medical history, laboratory indicators of cytolytic and cholestatic syndromes for the differential diagnosis of fatty liver of various etiologies.
Full Text
АКТУАЛЬНОСТЬ
Важнейшая задача здравоохранения на современном этапе — разработка и осуществление комплексных научно-обоснованных программ по профилактике и лечению болезней детского и взрослого населения. Одним из приоритетных направлений современной медицины, объединяющим интересы различных специалистов (терапевтов, кардиологов, гастроэнтерологов, эндокринологов), является изучение патогенеза и клинических проявлений жировой дистрофии печени, имеющей широкую распространенность и безусловную социальную значимость [1, 6, 7].
В настоящее время термином «жировая дистрофия печени» (ЖДП) обозначают гетерогенную группу патологических изменений печени, характеризующихся жировой дистрофией гепатоцитов или воспалительной инфильтрацией на фоне жировой дистрофии гепатоцитов. Выделяют следующие стадии ЖДП: стеатоз печени (СП), стеатогепатит (СГ) и цирроз печени.
Основным этиологическим фактором развития СП и СГ остается алкоголь, роль которого прослеживается у 46–65 % пациентов. Накоплены убедительные данные, свидетельствующие, что ожирение, инсулинорезистентность также представляют собой факторы прогрессирования СП и СГ алкогольной и неалкогольной этиологии. Ожирению в развитии стеатогепатитов отводят около 76 % [18]. Одновременное влияние нескольких факторов, таких как алкоголь и ожирение, приводит к незамедлительному развитию СП и СГ у 95 % пациентов [19]. В связи с этим сегодня алкоголь, ожирение и инсулинорезистентность рассматривают как взаимодополняющие факторы поражения печени смешанного генеза [8, 9] или смешанной жировой дистрофии печени (СЖДП) [2, 3].
Особое внимание уделяется метаболическому синдрому, олицетворяющему в настоящее время одну из наиболее приоритетных и социально-значимых проблем как терапии, так и педиатрии [11]. Это обусловлено, в первую очередь, высокой распространенностью и прогрессирующим течением данного заболевания. Ранние осложнения проявляются симптомокомплексом, в который входят задержка темпов физического и полового развития и хроническое нарушение функции печени с формированием ее жировой дистрофии [5, 15].
Биомоделирование дает исследователю практически неограниченные возможности изучения причин болезни, ввиду, в том числе, заведомо известной прямой связи между действующим причинным фактором и развивающейся патологией [4, 13, 16]; в результате становится возможным применить строго контролируемую совокупность воздействующих на организм факторов, в том числе и патогенных, что невозможно осуществить в клинической практике.
Цель данного исследования — разработать, опробовать и оценить экспериментальную модель жировой дистрофии печени смешанного происхождения.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Выбор объекта исследования — крыс линии Wistar — неслучаен, он определен рядом факторов: генетической однородностью, что проявляется постоянством реакций на воздействие физических, химических, стрессорных влияний, а также спецификой морфологических и биохимических показателей и определенным уровнем сходства с таковыми у человека.
Исследование проведено на 30 самцах альбиносах серых крыс Wistar, массой тела на момент включения в исследование 220–240 г, на базе научно-исследовательской лаборатории кафедры патологической физиологии с курсом иммунопатологии ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Сформировано две группы животных:
- «Контроль» (n = 15) — здоровые, интактные крысы, у которых производили исследование параметров метаболизма для расчета фоновых, референсных значений («нормальные показатели»).
- «СЖДП» (n = 15) — крысы, которые на протяжении всего эксперимента в качестве корма получали брикеты, содержащие пищевые компоненты в следующих соотношениях (по массе): 31 % — белок, 15 % — животный жир, 30 % — фруктоза, 13 % — целлюлоза, 5 % — минеральные вещества, 1 % — витамины, и вместо питьевой воды 10 % раствор этанола [2].
Подопытные крысы, массой тела на момент включения в эксперимент 180–200 г, в течение 30 дней ежесуточно получали 20 г гранулированного корма для грызунов, в который вводили 6 г кристаллической фруктозы (из расчета 30 % общего рациона), а вместо питьевой воды в свободном доступе в поилке получали 10 % раствор этилового спирта. Режим двигательной активности животных был не ограничен.
С целью оценки метаболических нарушений у экспериментальных животных оценивали: биохимические показатели (концентрацию общего билирубина и прямой его фракции, активность ферментов щелочной фосфатазы, аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы, уровень общего холестерина и триглицеридов). Для подтверждения развития жировой дистрофии гистологическое исследование проводилось методом световой микроскопии, окраска гематоксилином и эозином, увеличение ×40.
Статистический анализ выполнен с помощью программ GraphPadPrism 8. Полученные в ходе работы данные проверены на нормальность распределения. Тип распределения определялся критерием Колмогорова – Смирнова, Шапиро – Уилка. Для сравнения контрольной и экспериментальной групп использовали однофакторный дисперсионный анализ ANOVA, так как выборка соответствует закону нормального распределения. Различия считали статистически значимыми при значении р < 0,05. Для представления полученных данных использовали такие показатели описательной статистики, как среднеарифметическое значение и ошибка среднего. Полноценный и качественный статистический анализ позволил минимизировать количество лабораторных животных в эксперименте.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Летальности в группах животных выявлено не было. В группе СЖДП произошло увеличение массы тела животных на 75,5 ± 2,1 г и массы печени, которая составила 12,7 ± 2,3 г, что на 48,5 % больше, чем в контроле (p < 0,05).
В экспериментальной группе СЖДП отмечалось повышение уровня внутриклеточных ферментов: аспартатаминотрансферазы по сравнению с контролем (127,6 ± 8,8 против 101,4 ± 6,5 Ед/л; p < 0,05), аланинаминотрансферазы по сравнению с контролем (39,6 ± 1,5 против 33,3 ± 2,9 Ед/л; p < 0,05). О развившемся синдроме холестаза свидетельствует достоверное повышение уровня щелочной фосфатазы по сравнению с контролем (28,9 ± 2,3 против 18,2 ± 1,3 Ед/л; р = 0,0005). Регистрировалось также достоверное повышение уровня глюкозы по сравнению с контролем (9,4 ± 1 против 5,0 ± 0,4 ммоль/л; р < 0,0001) (рис. 1).
Рис. 1. Изменение биохимических показателей в экспериментальной группе. *Достоверные отличия (р < 0,05). СЖДП — смешанная жировая дистрофия печени
У животных группы СЖДП на гистологических препаратах печени зарегистрировано значимое изменение балочной структуры (рис. 2). Стеатоз смешанного типа (мелко-крупнокапельное ожирение) следует расценивать как мелкокапельный, так как оба эти варианта прогностически менее благоприятны по сравнению с крупнокапельным. Воспалительный инфильтрат внутри долек содержит нейтрофилы, лимфоциты и гистиоциты.
Рис. 2. Жировая дистрофия печени смешанного генеза. Нарушение балочной структуры (биоптат печени, окраска гематоксилином и эозином, ×40)
ОБСУЖДЕНИЕ
Диеты западного стиля, содержащие большое количество жира, фруктозы (или сахарозы) и высокий уровень холестерина широко использовались для создания моделей ЖДП у крыс, поскольку такие диетические особенности были связаны с развитием данной патологии у людей и могут вызывать не только СГ, но также ожирение и инсулинорезистентность [10, 12]. Такие крысиные модели не идеальны, поскольку диетическое питание дорогостоящее и требует увеличения длительности эксперимента.
Этанол традиционно использовался для индуцирования повреждения печени и фиброза у крыс. В этом исследовании мы использовали этанол в качестве «ускорителя» СГ. Таким образом, этанол и западная диета проявляют синергетические эффекты для ускорения формирования СГ [14, 17]. Как и ожидалось, этанол усугубил СП, дольковое воспаление и баллонную дистрофию гепатоцитов, что соответствует аналогичным изменениям у пациентов-людей.
Сочетание двух основных факторов развития жировой болезни печени у человека — гиперкалорийное питание и употребление алкоголя при ежесуточном приеме — позволяют воспроизвести модель в наиболее короткие сроки — 30 дней, при отсутствии случаев летальности в экспериментальных группах. Это минимальный срок, за который происходит развитие жировой болезни печени у крыс.
На лабораторных крысах была разработана модель, которая повторяет гистологическую картину ЖДП. Функциональные пути метаболических нарушений в этой модели очень похожи на таковые при заболевании у человека. Простота, скорость и воспроизводимость этой модели делают ее идеальной для изучения патогенеза заболеваний и тестирования новых методов лечения.
ВЫВОДЫ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ
- Предложенный способ моделирования СЖДП отражает наиболее важные этиологические факторы и механизмы формирования патологии печени, позволяет сократить сроки эксперимента и дает 100 % воспроизводимость у подопытных животных. Он не сложен в техническом воспроизведении и создает условия для проведения оригинальных и имеющих важное практическое значение для гепатологии и экспериментальной медицины работ.
- Предложенная крысиная модель СЖДП демонстрирует быстрое прогрессирование СГ и имитирует гистологические и биохимические особенности человеческого СГ, предполагая, что она станет полезным экспериментальным инструментом для доклинического тестирования фармакологических препаратов.
Разработанная в ходе исследования модель ЖДП может быть использована в дальнейших фундаментальных исследованиях по изучению патогенеза этой патологии и служить теоретическим обоснованием целесообразности фармакологической коррекции у подопытных животных, которое в последствии возможно экстраполировать на человека.
ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.
Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.
Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.
Этический комитет. Протокол исследования был одобрен локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Минздрава России (протокол № 09/04 от 11.02.2022).
ADDITIONAL INFORMATION
Authors’ contribution. Thereby, all authors made a substantial contribution to the conception of the study, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the article, final approval of the version to be published, and agree to be accountable for all aspects of the study.
Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.
Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.
Ethics approval. The present study protocol was approved by the local of St. Petersburg State Pediatric Medical University of the Russian Ministry of Health (Protocol No. 09/04, 2022 Feb 11).
About the authors
Tatiana V. Brus
Saint Petersburg State Pediatric Medical University
Author for correspondence.
Email: bant.90@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7468-8563
SPIN-code: 9597-4953
MD, PhD, Associate Professor, Department of Pathological Physiology with the course of Immunopathology
Russian Federation, Saint PetersburgAndrei G. Vasiliev
Saint Petersburg State Pediatric Medical University
Email: avas7@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8539-7128
SPIN-code: 1985-4025
MD, PhD, Dr. Sci. (Medicine), Chairman of the Department of Pathological Physiology with the Сourse of Immunopathology
Russian Federation, Saint PetersburgAleftina A. Kravcova
Saint Petersburg State Pediatric Medical University
Email: aleftinakravcova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0657-3390
SPIN-code: 6762-1182
Associate Professor, Department of Pathological Physiology with the course of Immunopathology
Russian Federation, Saint PetersburgAnna V. Vasilieva
Saint Petersburg State Pediatric Medical University
Email: a-bondarenko@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0008-2356-1552
SPIN-code: 5333-0144
Assistant Professor, Department of Pathological Physiology with the Course of Immunopathology
Russian Federation, Saint PetersburgYurii S. Brus
Saint Petersburg State Pediatric Medical University
Email: brusyury@gmail.com
ORCID iD: 0009-0004-8932-8076
1st year master's student in the specialty “Public Health and Healthcare”
Russian Federation, Saint PetersburgAnastasia V. Bannova
V.I. Vernadsky Crimean Federal University
Email: bannova06@list.ru
ORCID iD: 0009-0007-6867-9477
1st year student of the 1st medical faculty of the S.I. Georgievsky Medical Institute
Russian Federation, SimferopolReferences
- Brus TV, Vasiliev AG. Up-to-date concept of non-alcoholic fatty liver disease. Russian Biomedical Research. 2020;5(1):18–25.
- Patent RUS № 2757199/ 12.10.2021. Byul. No. 29. Brus TV, Vasiliev AG, Trashkov AP, et al. Method of modeling fatty liver disease of mixed genesis in rats. (In Russ.)
- Brus TV, Evgrafov VA. Pathophysiology of hepatic insufficiency. Pediatrician (St. Petersburg). 2022;13(3):55–64. doi: 10.17816/PED13355-64
- Kim АE, Shustov EB, Tsygan VN, et al. Metabolic effects of long-term exposure to wave-like oxygen fasting of moderate severity. Russian Biomedical Research. 2023;8(2):4–11. doi: 10.56871/RBR.2023.46.59.001
- Novikov VS, Shanin VYu, Akylbekov IK, et al. Hypoxia. Adaptation, pathogenesis, clinic. Saint-Petersburg: Elbi-SPb, 2000. 384 p. (In Russ.)
- Savchenko YV, Sergievskaya ZA, Lopatieva SO. Non-alcoholic fatty liver degeneration in people of different age groups: A modern view of the problem. University Therapeutic Journal. 2022;4(1):11–21. doi: 10.56871/4338.2022.10.13.002
- Trashkov AP, Brus TV, Vasiliev AG, et al. Biochemical profile of rats with non-alcoholic fatty liver disease of various gravity and its correction with Remaxol. Pediatrician (St. Petersburg). 2017;8(4):78–85. doi: 10.17816/PED8478-85
- Åberg F, Puukka P, Salomaa V, et al. Risks of light and moderate alcohol use in fatty liver disease: follow-up of population cohorts. Hepatology. 2020;71(3):835–848. doi: 10.1002/hep.30864
- De Alwis NMW, Day CP. Nonalcoholic fatty liver disease: The mist gradually clears. J Hepatol. 2008;48(S1):104–112. doi: 10.1016/j.jhep.2008.01.009
- Boyle M, Masson S, Anstee QM. The bidirectional impacts of alcohol consumption and the metabolic syndrome: cofactors for progressive fatty liver disease. J Hepatol. 2018;68(2):251–267. doi: 10.1016/j.jhep.2017.11.006
- Chang Y, Cho YK, Kim Y, et al. Nonheavy drinking and worsening of noninvasive fibrosis markers in nonalcoholic fatty liver disease: a cohort study. Hepatology. 2019;69(1):64–75. doi: 10.1002/hep.30170
- Cotrim HP, Parise ER, Oliveira CPMS, et al. Nonalcoholic fatty liver disease in Brazil. Clinical and histological profile. Ann Hepatol. 2011;10(1):33–37. doi: 10.1016/S1665-2681(19)31584-4
- Lassale C, Tzoulaki I, Moons KGM, et al. Separate and combined associations of obesity and metabolic health with coronary heart disease: a pan-European case-cohort analysis. Eur Heart J. 2018;39(5):397–406. doi: 10.1093/eurheartj/ehx448
- Lomonaco R, Ortiz-Lopez C, Orsak B, et al. Effect of adipose tissue insulin resistance on metabolic parameters and liver histology in obese patients with nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 2012;55(5):1389–1397. doi: 10.1002/hep.25539
- Mitra S, De A, Chowdhury A. Epidemiology of non-alcoholic fatty liver diseases. Transl Gastroenterol Hepatol. 2020;5:16. doi: 10.21037/tgh.2019.09.08
- Rich NE, Oji S, Mufti AR, et al. Racial and ethnic disparities in nonalcoholic fatty liver disease prevalence, severity, and outcomes in the United States: a systematic review and meta-analysis. Clin Gastroenterol Hepatol. 2018;16(2):198–210. doi: 10.1016/j.cgh.2017.09.041
- Romero-Gomez M, Zelber-Sagi S, Trenell M. Treatment of NAFLD with diet, physical activity and exercise. J Hepatol. 2017;67(4): 829–846. doi: 10.1016/j.jhep.2017.05.016
- Winkler TW, Gunther F, Hollerer S, et al. A joint view on genetic variants for adiposity differentiates subtypes with distinct metabolic implications. Nat Commun. 2018;9(1):1946. DОI: 10.1038/s41467-018-04124-9
- Younossi ZM, Stepanova M, Ong J, et al. Effects of alcohol consumption and metabolic syndrome on mortality in patients with non-alcoholic and alcohol-related fatty liver disease. Clin Gastroenterol Hepatol. 2018;17(8):1625–1633. doi: 10.1016/j.cgh.2018.11.033