Importance of activity of autophagy, apoptosis and intracellular protein degradation for early detection of malnutrition in patients with chronic kidney disease of 5th stage, receiving of hemodialysis: the results of case-control study

Full Text

Актуальность

Хроническая болезнь почек (ХБП) служит одной из ведущих причин заболеваемости и смертности во всем мире [18]. Синдром недостаточности питания ухудшает течение и прогноз заболевания [5,  15,  19]. Его верифицируют на основании вычисления индекса массы тела (ИМТ). Снижению массы тела соответствует снижение ИМТ. Низкий ИМТ ассоциирован с высокой летальностью от ХБП [14]. Неоценимую помощь в диагностике синдрома недостаточности питания может оказать выявление ранних чувствительных маркеров. В настоящее время такими маркерами являются уровень сывороточного альбумина, лимфоцитов, насыщение трансферрина и др. [2,  4,  16]. Оптимальный набор таких показателей до конца не определен. Аутофагия, апоптоз и внутриклеточная деградация белка сопровождают течение ХБП 5-й стадии. Известна их негативная роль в течении заболевания [6,  8,  10,  11]. При этом неясно, могут ли показатели, характеризующие указанные патологические процессы, являться ранними маркерами синдрома недостаточности питания.

Цель — выявить чувствительные маркеры ранней диагностики синдрома недостаточности питания и установить пригодность для этой цели показателей аутофагии, апоптоза и внутриклеточной деградации белка.

Материал и методы

Дизайн исследования. Выполнено проспективное исследование «случай – контроль».

Критерии соответствия. Критерии включения: пациенты с хронической болезнью почек 5-й стадии, получающие гемодиализ. Критерии невключения: хроническая болезнь почек 1–4-й стадий; отсутствие хронического диализного лечения; хронический перитонеальный диализ; возраст менее 18 и старше 80 лет; патология мышечной ткани; наркомания и алкоголизм; психические заболевания, подтвержденные документально; отказ от участия в исследовании.

Условия проведения. Исследования проводили на базе кафедры внутренних болезней № 2 ФГБУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ (Ростов-на-Дону, Россия); диализного центра «ООО «Фрезениус Медикал Кеа Кубань» (Ростов-на-Дону, Россия), лаборатории медицинского центра ООО «Новомедицина» (Ростов-на-Дону, Россия).

Продолжительность исследования: 01.08.2016–01.12.2017.

Описание медицинского вмешательства. Проводили детальный сбор клинико-анамнестических данных, физикальное и лабораторное обследования, включавшие сбор жалоб, анамнеза, объективный осмотр, анализ активности внутриклеточной деградации белка (20S-протеасомы), аутофагии (Beclin-1) и апоптоза (Bcl-2).

В исследование вошло 106 пациентов, соответствующих критериям включения, гемодиализ которым осуществляли на аппаратах 5008 CorDiax (Fresenius Care, Германия) с использованием бикарбонатной буферной диализной жидкости и полисульфоновых высокопоточных диализных мембран FX 50, FX 60, FX 80 или FX 100, площадь поверхности от 1,5 до 2,3 м2, три раза в неделю по 4 часа. Средний возраст пациентов составил 50,9 ± 12,3 года, средняя продолжительность диализного лечения — 32,8 (17,5–48,5) месяца. У 80 пациентов определяли активность показателей аутофагии, апоптоза и внутриклеточной деградации белка. Первую группу составили пациенты с синдромом недостаточности питания (n = 71), вторую группу — пациенты без синдрома недостаточности питания (n = 9). Средний возраст составил 50,7 ± 12,4 и 52,2 ± 12,0 года (р = 0,682) в группах с недостаточностью и без недостаточности питания соответственно. Верификацию ауто­фагии, апоптоза и внутриклеточной деградации белка выполняли на основании определения уровня Beclin-1, Bcl-2 и 20S-протеасомы соответственно. Активность (уровень) показателей определяли методом количественного иммуноферментного анализа на иммуноферментном анализаторе BRIO-ELISA (RADIM, США): Beclin-1 — при помощи набора ELISA Kit for Beclin 1 (Cloud-Clone Corp., США), 20S-протеасомы — набора ELISA Kit for 20S-Proteasome (Cloud-Clone Corp., США), Bcl-2 — набора ELISA Kit for B-Cell Leukemia/Lymphoma 2 (Cloud-Clone Corp., США). Биоимпедансный анализ выполняли при помощи биоимпедансного анализатора Вody Composition Monitor (ВСМ) — монитор состава тела с программным обеспечением Fluid Management Tool (FMT) фирмы Fresenius (Германия, регистрационное удостоверение № ФСЗ 2009/03662 от 05.02.2009). Уровни активности («высокая» и «низкая», min–max) определяли с применением кластерного анализа: для Beclin-1 он равнялся 1,9–3,1 и 1,1–1,9 нг/мл, для 20S-протеасомы — 46,2–72,5 и 24,7–46,2 нг/мл; для Bcl-2 — 2,9–6,1 и 1,1–2,7 нг/мл соответственно. Уровни альбумина и трансферрина измеряли в крови с периодичностью 1 раз в месяц в течение двенадцати месяцев по стандартным лабораторным методикам. Для каждого показателя вычисляли средние значения за указанный период. ИМТ рассчитывали по стандартной формуле: ИМТ = масса, кг/(рост, см)2 [21]. Дефицит массы тела определяли как процент снижения массы тела по отношению к идеальной (ИдМТ). Последнюю вычисляли по формуле B. Devine для мужчин — ИдМТ = 50 + 2,3 (0,394 × рост – 60), для женщин — ИдМТ = 45,5 + 2,3 (0,394 × рост – 60) [9]. Дефицит висцерального пула белка определяли при уровне сывороточного альбумина < 35 г/л, соматического — по стандартной формуле: ОМП (см) = ОП (см) – 0,314 × КЖСТ (мм), где ОМП — окружность мышц плеча, ОП — окружность плеча, КЖСТ — толщина кожно-жировой складки над трицепсом. За дефицит принимали значение ОМП менее 22 см у женщин и менее 24 см у мужчин [2].

Этическая экспертиза. Протокол исследования одобрен локальным независимым этическим комитетом ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России (протокол № 13/18 от 13.09.2018).

Статистический анализ. Размер выборки предварительно не рассчитывали. Использовали пакеты прикладных программ Excel-2016 (Microsoft Corp., США), Statistica-12 (StatSoft, США). Количественные показатели при их нормальном распределении представляли в виде M ± SD, при распределении, отличном от нормального, — Me (нижний квартиль — LQ, верхний квартиль — HQ). Характер распределения (нормальное или отличное от нормального) оценивали при помощи одновременного вычисления для каждого показателя критериев Колмогорова – Смирнова, Шапиро – Уилка и Лиллие­форса. Распределение считали отличным от нормального, если два и более критериев отвергали нулевую гипотезу. Статистическую значимость различий количественных переменных определяли для двух выборок путем вычисления t-критерия Стьюдента при нормальном распределении или критерия Манна – Уитни для показателей, распределение которых отличалось от нормального. Статистическую значимость различий для качественных/порядковых переменных определяли при помощи критерия хи-квадрат для таблиц сопряженности вида 2 × 2 или точного критерия Фишера, если количество наблюдений в одной из ячеек четырехпольной таблицы было < 5. Вероятность синдрома недостаточности питания при высоком уровне показателей аутофагии, апоптоза и внутриклеточной деградации белка рассчитывали с использованием бинарной одновходовой логистической регрессии с вычислением отношения шансов (ОШ) и 95 % доверительного интервала (95 % ДИ). Частоты двух дихотомических переменных, относящихся к одной и той же выборке, сравнивали с применением методики ANOVA и критерия Фридмана. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты

Синдром недостаточности питания традиционно верифицируют при наличии у пациента одного из следующих признаков: уровень альбумина крови < 35 г/л; насыщение трансферрина < 20 %; содержание лимфоцитов крови < 1,8 тыс.; ИМТ < 18,5 [4, 16].

Частота синдрома недостаточности питания варь­ировала в зависимости от используемого для его верификации показателя. Наибольшая частота указанного синдрома отмечалась при применении критерия «уровень лимфоцитов». У 71,1 % больных (59 из 83 пациентов, у которых измерен показатель) уровень лимфоцитов был ниже референсного предела (< 1,8 тыс.). У большинства больных синдром недостаточности питания по уровню лимфоцитов верифицирован как среднетяжелый — 36,1 % (30), у 27,7 % (23) — легкой степени, у 7,2 % (6) — тяжелой степени [4]. Снижение показателя насыщения трансферрина < 20 % (по среднему) имело место у 34 % (36 из 106). Уменьшение среднего уровня альбумина < 35 г/л (по среднему) отмечалось только у 1,9 % (2 из 106) пациентов. Падение ИМТ < 18,5 наблюдалось только у 1 пациента (0,9 %).

В качестве дополнительного критерия синдрома недостаточности питания использовали показатель дефицита массы тела, который был зарегистрирован у 5,7 % (6) пациентов, в том числе у 4,7 % (5) дефицит массы тела соответствовал легкой степени (10–20 %), у 0,9 % (1) — средней (20–30 %). Тяжелого дефицита массы тела зафиксировано не было (> 30 %).

Синдром недостаточности питания диагностировали, когда у одного пациента регистрировали один или несколько критериев: уровень альбумина (средний) < 35 г/л; насыщение трансферрина < 20 %; уровень лимфоцитов < 1,8 тыс.; ИМТ < 18,5.

Изучение активности показателей аутофагии, апоптоза и внутриклеточной деградации белка показало более высокий уровень 20S-протеасомы и низкий Beclin-1 в группе с недостаточным питанием (табл. 1).

 

Таблица 1 / Table 1

Активность показателей аутофагии, апоптоза и внутриклеточной деградации белка в зависимости от наличия синдрома недостаточности питания

Activity of indications of autophagy, apoptosis and intracellular protein degradation depending on malnutrition syndrome

Показатель / Indication	Группы / Groups						р
	С недостаточным питанием (n = 71) / With malnutrition (n = 71)			Без недостаточности питания (n = 9) / Without malnutrition (n = 9)
	Me	LQ	HQ	Me	LQ	HQ
Beclin-1, нг/мл / Beclin-1, ng/ml	1,4	1,3	1,8	1,8	1,6	2,1	0,041
20S-протеасома, нг/мл / 20S-proteasome, ng/ml	61,9	51,4	68,2	50,5	45,7	58,9	0,009
Bcl-2, нг/мл / Bcl-2, ng/ml	4,1	3,4	4,5	3,6	2,4	4,3	0,221

 

Установлена сильная корреляционная зависимость между показателями протеасомной деградации белка, аутофагии и апоптоза: отрицательная связь между уровнем 20S-протеасомы и Beclin-1 (r = –0,961; p < 0,05), положительная — между 20S-протеасомой и Bcl-2 (r = 0,780; р < 0,05), отрицательная — между Beclin-1 и Bcl-2 (r = –0,792; p < 0,05).

Анализ корреляции между показателями, определяющими наличие синдрома недостаточности питания и показателями аутофагии, апоптоза и внутриклеточной деградации белка, показал слабую отрицательную корреляционную связь между насыщением трансферрина и Bcl-2 (r = –0, 243; р < 0,05).

В результате изучения ассоциации уровня активности аутофагии, апоптоза и внутриклеточной деградации белка с недостаточностью питания было установлено, что высокий уровень 20S-протеасомы повышает шанс развития синдрома недостаточности питания. Доля пациентов с мальнутрицией в группах с высокой и низкой активностью 20S-протеасомы составила 92,4 % (61 из 66) и 71,4 % (10 из 14; ОШ = 4,88 [95 % ДИ = 1,09–21,84]). Для Beclin-1 и Bcl-2 указанная зависимость не наблюдалась.

Не было выявлено статистически значимого различия частоты встречаемости недостаточности соматического и висцерального пулов белка в исследуемых группах, однако обнаружено, что недостаточность соматического пула встречалась статистически значимо чаще по сравнению с недостаточностью висцерального пула в группе недостаточности питания (табл. 2).

 

Таблица 2 / Table 2

Недостаточность соматического и висцерального пула белка у пациентов с недостаточностью питания и без нее

Insufficiency of somatic and visceral pools of proteins in patients with and without malnutrition

Показатель / Indication	Группы /  Groups				р
	С недостаточностью  питания (n = 93) / With malnutrition (n = 93)		Без недостаточности  питания (n = 13) / Without malnutrition (n = 13)
	Абс. / Abs.	%	Абс. / Abs.	%
Недостаточность соматического пула белка (1) / Somatic protein pool’ insufficiency (1)	24	25,8	2	15,4	0,332
Недостаточность висцерального пула белка (2) / Visceral protein pool’ insufficiency (2)	2	2,2	0	0,0	0,769
p1,2	0,000		1,000		–

 

Не выявлено взаимосвязи частоты коморбидной патологии и наличия синдрома недостаточности питания. В обеих исследуемых группах преобладала патология сердечно-сосудистой системы — в группе недостаточности питания 95,7 % (89 из 93), без недостаточности питания — 92,3 % (12 из 13; р = 0,673); наиболее часто встречалась гипертоническая болезнь — 89,2 % (83) и 92,3 % (12; р = 0,487) соответственно. В то же время средний уровень систолического артериального давления в группе недостаточности питания был статистически значимо ниже — 141,6 ± 14,6 и 151,5 ± 13,0 мм рт. ст. (р = 0,024). Показатели диа­столического артериального давления и частоты сердечных сокращений в соответствующих группах не отличались: 75,6 ± 11,7 и 81,2 ± 11,3 мм рт. ст. (р = 0,107); 73,3 ± 10,7 и 77,5 ± 11,1 мм рт. ст. (р = 0,190). Второе ранговое место принадлежало сочетанной нефрологической патологии: в группе недостаточности питания — 43 % (40), без недостаточности питания — 38,5 % (5; р = 0,756). Наиболее часто отмечался хронический гломерулонефрит — 32,3 % (30) и 38,5 % (5) соответственно (р = 0,656). Шесть с половиной процентов (6) пациентов с недостаточностью питания перенесли трансплантацию почки, в то время как в группе без недостаточности питания трансплантации почки не проводилось (р = 0,447). Эндокринная патология занимала третье ранговое место и отмечалась в группе недостаточности питания у 21,5 % (20), без недостаточности питания — у 15,4 % (2; р = 0,465). У большинства пациентов наблюдалось сочетание двух и более нозологий: 67,7 % (63) и 77,0 % (10; р > 0,05).

Показатели эффективности диализного лечения в группах статистически значимо не отличались: длительность диализного лечения составила 33,0 (19,0–51,0) мес. и 23,0 (7,5–35,5) мес. (р = 0,088); Kt/V 1,6 (1,4–1,7) и 1,6 (1,5–1,7; р = 0,747); коэффициент снижения мочевины 78,3 % (75,7–81,6) и 78,9 % (77,2–81,0; р = 0,769); доза диализа 1,0 ± 0,2 и 1,0 ± 1,0 г/кг/сут (р = 0,777). Адекватный диализ (Kt/V = 1,2–1,5) был у 51,1 % (47 из 92) и 46,2 % (6 из 13; р = 0,739); оптимальный диализ (Kt/V = 1,6–2,2) отмечен у 43,5 % (40) и 30,8 % (4; р = 0,299), неадекватный (Kt/V < 1,2) — у 5,4 % (5) и 15,4 % (2; р = 0,208) соответственно, идеальный — у 7,7 % (1; р = 0,208) только в группе без нарушения питания

При изучении состава тела (сухой вес, вес до диализа, окружность талии, бедра, шеи, плеча, запястья, толщина кожной складки над трицепсом, бицепсом, лопаткой, в подвздошной области, суммарная толщина кожных складок, жировая масса, безжировая масса, активная клеточная масса, общая вода, общий объем жидкости, объем внеклеточной и внутриклеточной жидкости, общий обмен и метаболический возраст) не было выявлено статистически значимых различий средних значений показателей в группах пациентов с наличием и отсутствием синдрома недостаточности питания. В то же время установлено, что у большинства больных ИМТ превышал референсный интервал — 68,8 % (64 из 93) в группе недостаточности питания и 69,2 % (9 из 13) в группе без недостаточности питания (р = 0,624). Увеличение массы тела происходило за счет жировой, активной клеточной и безжировой массы. Абсолютный показатель жировой массы, превышающий референсный предел, зарегистрирован у 60,2 % (56) и 53,8 % (7; р = 0,661), абсолютный показатель активной клеточной массы, превышающий референсный предел, — у 95,7 % (89) и 84,6 % (11; р = 0,157) в группах с нарушением и без нарушения питания соответственно. Существенно, что при этом почти у половины больных обеих групп относительный показатель активной клеточной массы (в %) был ниже референсного предела — 52,7 % (49) и 46,2 % (6) соответственно (р = 0,659). Безжировая (костно-мышечная) масса у большинства пациентов обеих групп была повышена — 78,5 % (73) и 84,5 % (11; р = 0,465). Сухой вес превышал референсный предел у подавляющего большинства пациентов: 93,5 % (87) в группе недостаточности питания и 92,3 % (12) без нее (р = 0,611); у остальных больных каждой группы сухой вес соответствовал референсному коридору.

Изучение общего объема жидкости показало, что у большинства больных он соответствовал величине референсного интервала — 67,7 % (63) и 61,6 % (8) в группах с недостаточностью питания и без нее (р = 0,656). Также у большинства больных объем внеклеточной жидкости не выходил за пределы референсных значений — 75,3 % (70) и 69,2 % (9) соответственно (р = 0,432). В то же время снижение объема внутриклеточной жидкости отмечено у большинства пациентов группы недостаточности питания и почти у половины пациентов в группе без нее — 63,4 % (59) и 46,2 % (6) (р = 0,231).

Интерес представляет тот факт, что показатель основного обмена превышал верхний референсный предел у 98,9 % (92) в группе с недостаточностью питания и у 100 % (13) без нее (р = 0,877).

Не было выявлено существенных межгрупповых различий по показателям мышечной функциональности (динамометрия на ведущей руке, бесфистульной руке, правой и левой руках, проба с поднятием ноги).

Обсуждение

Среди исследуемых пациентов с ХБП 5-й стадии у подавляющего большинства присутствовал синдром недостаточности питания (93 из 106 в общей группе и 71 из 80 среди больных, которым выполнена оценка показателей аутофагии, апоптоза и внутриклеточной деградации белка). Многочисленные исследования продемонстрировали неблагоприятное влияние синдрома недостаточности питания на течение и исход различных заболеваний [5, 14, 15, 20, 22].

Для своевременного назначения корригирующей диетотерапии и других лечебных воздействий большое значение имеет раннее выявление синдрома недостаточности питания. Уровень лимфоцитов < 1,8 тыс. у пациентов с ХБП 5-й стадии оказался наиболее чувствительным показателем для установления диагноза синдрома недостаточности питания, поскольку был верифицирован у 71,1 % больных. Чуть менее значимым был показатель «насыщение трансферрина < 20 %», зарегистрированный у 34 %. В то же время антропометрический показатель ИМТ был снижен только у 0,9 %, а показатели композиционного состава тела в группах с недостаточностью питания и без нее вообще статистически значимо не различались как по абсолютному значению, так и по частоте отклонений от референсных значений. Выявленные нами факты свидетельствуют, что для ранней диагностики нутритивных нарушений предпочтительны лабораторные методы. Представленные в литературе данные демонстрируют, что лимфоциты служат наиболее тонким индикатором, так как раннее снижение уровня лимфоцитов ассоциировано с нутритивными нарушениями. Использование в рационе пациентов хирургического профиля в возрасте от 46 до 76 лет сбалансированной смеси для клинического энтерального питания, содержащей оптимальное, сопоставимое с суточной физиологической потребностью количество омега-3 жирных кислот, L-карнитина, L-глутамина и аминокислот BCAA, в течение 5 суток перед операцией (гемиколэктомии, резекции желудка и прямой кишки) показало, что в группе, получавшей указанную смесь через 24 ч, 3–5 и 7–10 суток после операции, абсолютный показатель лимфоцитов, B-lymph CD19, T-lymph CD3, T-helper CD3⁺CD4, T-lymph CD3⁺CD8, NK CD3 (CD16⁺56) и NKT CD3⁺CD(16⁺56) — был статистически значимо выше по сравнению с контрольной группой [3].

Оценка нутритивного статуса посредством определения уровня биомаркеров является значимым предиктором исходов и в онкологии. Доказано снижение общей выживаемости пациентов, страдающих раком мочевой системы, при снижении прогностического трофического индекса (PNI) [22]. Активацию опухолевых клеток контролируют цитокины, количество которых при снижении уровня лимфоцитов также снижается [23]. На фоне ухудшения нутритивного статуса происходило повышение 90-дневной летальности и снижение трехлетней выживаемости пациентов с раком мочевого пузыря. Синдром недостаточности питания у таких больных выявляли путем определения уровней сывороточного альбумина, предоперационного снижения массы тела и ИМТ [13]. Значимое место прогнозированию нутритивной недостаточности отводится и в педиатрии [1].

В то же время мы установили, что синдром недостаточности питания у пациентов с ХБП 5-й стадии сильнее ассоциирован с соматическим пулом белка, определяемым на основании антропометрических измерений, чем с висцеральным, определяемым исходя из уровня сывороточного альбумина. При этом снижение уровня сывороточного альбумина значимо увеличивает послеоперационную летальность больных с раком мочевого пузыря [17].

Мы выяснили, что высокий уровень 20S-протеасомы, которая является маркером активности внутриклеточной деградации белка, статистически значимо ассоциирован с синдромом недостаточности питания. Аберрация механизмов утилизации белка сочетается с развитием онкологических и дегенеративных заболеваний, а лекарственное воздействие на процесс утилизации улучшает исходы лечения и тормозит прогрессирование заболевания. При этом механизм функционирования убиквитин-протеасомной системы до конца не расшифрован [7, 12].

Выводы

1. Наибольшая частота синдрома недостаточности питания отмечена при использовании биомаркеров «уровень лейкоцитов < 1,8 тыс.» — у 71,1 % и «насыщение трансферрина < 20 %» — у 34 % пациентов, что позволяет использовать эти показатели для раннего выявления нутритивных нарушений у больных с ХБП 5-й стадии.
2. Показатели антропометрии и биоимпедансного анализа у пациентов с ХБП 5-й стадии и синдромом недостаточности питания существенно не различались, что может означать более позднюю их реакцию на развитие указанного синдрома, в связи с чем их применение менее предпочтительно для ранней диагностики нутритивных нарушений у больных с ХБП 5-й стадии.
3. При синдроме недостаточности питания активируется внутриклеточная деградация белка, о чем свидетельствует повышение 20S-протеасомы, высокий уровень которой (46,2–72,5 нг/мл) может быть независимым предиктором нутритивных расстройств у пациентов с ХБП 5-й стадии, получающих программный гемодиализ.
4. Синдром недостаточности питания при ХБП 5-й стадии сопровождается истощением прежде всего соматического пула белка, о чем свидетельствует более высокая частота встречаемости его дефицита у больных с нутритивными нарушениями.

About the authors

Galina A. Prometnaya

Rostov Regional Children Clinical Hospital

Author for correspondence.
Email: galusik.ru@gmail.com

Nephrologist, Consultation-and- diagnostical Outpatient medical center

Russian Federation, Rostov-on-Don

Mikhail M. Batushin

Rostov State Medical University of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: batjushin-m@rambler.ru

MD, PhD, Dr Med Sci, Professor, Department of Internal Diseases No 2

Russian Federation, Rostov-on-Don

Nikolay B. Bondarenko

Rostov State Medical University of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: n.bondarenko61@gmail.com

Postgraduate Student, Department of Internal Diseases No 2

Russian Federation, Rostov-on-Don

References

Supplementary files