The foci of aberrant crypts and changes of microbiota of gut upon chemical mutagenesis and experimental hyperand hypothyroid status

Sergei N. Proshin; Прошин Сергей Николаевич; Ruslan A. Kurbanov; Курбанов Руслан Абдулрашидович; Svyatoslav I. Loskutov; Лоскутов Святослав Игоревич; Nikita N. Barsukov; Барсуков Никита Николаевич; Hajimurad O. Alibekov; Алибеков Хаджимурад Омарович; Dmitrii A. Kachanov; Качанов Дмитрий Александрович; Ruslan I. Glushakov; Глушаков Руслан Иванович; Georgii O. Bagaturiya; Багатурия Георгий Отарович

doi:10.17816/PED9663-72

The foci of aberrant crypts and changes of microbiota of gut upon chemical mutagenesis and experimental hyperand hypothyroid status

Authors: Proshin S.N.¹, Kurbanov R.A.², Loskutov S.I.³, Barsukov N.N.¹, Alibekov H.O.¹, Kachanov D.A.¹, Glushakov R.I.⁴, Bagaturiya G.O.²
Affiliations:
1. North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov
2. St Petersburg State Pediatric Medical University, Ministry of Healthcare of the Russian Federation
3. Limited Liability Company “Scientific production association “BioEcoTech”
4. Military Medical Academy named after S.M. Kirov
Issue: Vol 9, No 6 (2018)
Pages: 63-72
Section: Articles
URL: https://journals.eco-vector.com/pediatr/article/view/11226
DOI: https://doi.org/10.17816/PED9663-72
ID: 11226

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

In our paper we present data on the induction of nitrosomethylurea focuses of aberrant crypts on experimentally altered thyroid status in mice and concomitant changes in the intestinal microbiota. Since the foci of aberrant crypts are an obvious prerequisite for long-range malignancy in colorectal cancer, the induction of colorectal cancer induced by nitrosomethylurea is the most appropriate model for investigating mechanisms of carcinogenesis. Male BALB / c male mice which were treated with nitrosomethylurea (NMU) for 24 weeks when also combined with L-thyroxin or propylthiouracil were used in the study. The results indicate that the incidence of aberrant crypt foci (FAC) was significantly higher for a group of animals which were treated with both NMU and L-thyroxin 38.9 ± 3.6%. At the same time the incidence of FAC with hyperthyroid status only without exposure to NMU was also high at 12.9 ± 4.2%. It was shown that the hypothyroid status had a significant protective effect on the intestinal epithelium when exposed to HMN – 16.1 ± 2.5%. A significant quantitative decrease in Lactobacillus spp. of microbiome was detected in groups of mice exposed not only to NMU, but also in animals with experimentally induced hyperthyroid status only. Mechanisms that contribute to the occurrence of an increased frequency of FAC in the context of hyper- and hypothyroid status are discussed. It was concluded that an increased incidence of foci of aberrant crypts and a decrease in the quantity of the normal microbiota are associated with hyperthyroid status which modulated upon administration of methylnitrosourea.

Keywords

nitrosomethylurea, hyper- and hypothyroid status, foci of aberrant crypts, microbiota of gut

Full Text

Актуальность

К настоящему времени индукция рака метилнитрозомочевиной (МНМ) является наиболее приемлемой моделью для исследования механизмов канцерогенеза, особенно рака прямой кишки. Как и при спорадически возникающем колоректальном раке у человека, по результатам экспериментальных исследований на животных можно провести аналогию появления у них в кишечнике морфологических изменений, возникновения фокусов клеточной пролиферации эпителия и даже «клинических» проявлений этого заболевания. Важная особенность МНМ в отличие от азоксиметана заключается в том, что МНМ не подвергается метаболической трансформации, что исключает определенные затруднения в интерпретации получаемых результатов [28]. Стадия возникновения фокусов аберрантных крипт (ФАК) предшествует этапу, на котором воздействие МНМ на кишечный эпителий может быть со всей очевидностью визуализировано гистологически [23]. К настоящему времени доказано, что ФАК, прежде всего на молекулярном уровне, служат предпосылкой для дальней малигнизации в колоректальный рак и/или выступают серьезным фактором риска возникновения рака прямой кишки [29, 31]. К возникновению ФАК могут приводить разнообразные причины: семейный аденоматозный полипоз и наследственный неполипозный полипоз [15, 21], наследственная предрасположенность, то есть колоректальный рак у одного из родителей [16]. Также исследуется взаимосвязь между изменениями и активностью микробиома и его метаболома и возникновением рака прямой кишки [26]. Низкая частота возникновения рака выявлена у пациентов, пораженных гидатидным эхинококкозом [10]. Не регистрируется колоректальный рак у пациентов с американским трипаносомозом [32]. В экспериментальной модели показано, что животные, у которых персистируют такие представители трансмиссивных протозойных агентов, как Trypanosoma cruzi, Toxoplasma gondii и Plasmodium yoelii, более устойчивы к опухолевому росту [13, 20, 27]. С другой стороны, имеются данные, указывающие, что пациенты, у которых персистируют Cryptosporidium spр., принадлежащие к группе Firmicutes, более подвержены колоректальному раку [34]. Таким образом, очевидно, что микросимбиоценоз, находясь в тесной взаимосвязи с биотопом организма человека, формирует определенное состояние гомеостаза, зависящее не только от макропартнера, но и, в частности, от качественного и количественного состава микробиоты (эубиоз/дисбиоз). Кишечный дисбиоз способствует развитию, формированию и прогрессированию хронических воспалительных процессов в различных органах, в том числе воспалительных заболеваний в ЖКТ [7]. В настоящее время установлено, что повышенная активность бактерий Yersinia spp. из группы Enterobacteriaceae и H. рylori из группы Proteobacteria тесно ассоциирована с патологией щитовидной железы [14]. А это, в свою очередь, может привести к опухолям различных локализаций. Выявлена причинно-следственная связь между изменением состава микробиома у женщин и возникновением у них рака молочной железы [17]. Нанопептиды гипоталамического происхождения, будучи филогенетически более древними, обеспечивают тканям различного генеза реализацию их компенсаторных и приспособительных свойств при разнообразных воздействиях как на макроорганизм, так и на микробиом [9]. Так, например, установлен факт синергидного действия окситоцина с рядом антибактериальных препаратов in vitro и при лечении сепсиса у мышей, вызванного бактериями из группы Actinobacteria микробиома. К настоящему времени это позволило перейти к клинической апробации сочетанного использования антибиотиков с окситоцином при лечении гнойно-воспалительных заболеваний [33]. Показано, что эрадикационная фармакотерапия H. рylori, которая принадлежит к группе Proteobacteria, более эффективна при сочетании с применением L-тироксина для парентерального введения [30]. Выявлена отрицательная взаимосвязь между уровнем тиреоидных гормонов у новорожденных с сепсисом и летальным исходом, возможно, вследствие того, что микробиом тонкого кишечника может активно влиять на уровень тиреоидных гормонов организма [24, 25].

Целью исследования было оценить влияние экспериментально измененного тиреоидного статуса на формирование ФАК, индуцируемого МНМ, и микробиоту кишечника.

Методы исследования

В работе было использовано 100 мышей (♂) линии BALB/c массой 20 г (питомник «Рапполово» Ленинградской области), которых на протяжении эксперимента содержали в стандартных условиях 1.

Животные были поделены на шесть групп (табл. 1). Группу контроля составило десять животных (группа 1); десять животных получали только МНМ (группа 2); 20 животных — МНМ + L-тироксин (группа 3) и 20 животных — МНМ + ПТУ (пропилтиоурацил) (группа 4). Кроме того, были сформированы еще две группы по 20 животных без применения МНМ, одна из которых получала только L-тироксин (группа 5), а другая — только ПТУ (группа 6). Таким образом, чтобы достичь гипертиреоидного состояния использовали L-тироксин в концентрации 0,01 %, а чтобы достичь гипотиреоидного состояния — ПТУ в концентрации 0,5 %. Оба вещества добавляли в поилки. Для экспозиции животных к МНМ применяли метод ректального введения, при котором с помощью гибкого пластикового зонда МНМ доставляли в прямую кишку в концентрации 0,8 % [8]. Процедуру повторяли 1 раз в неделю в течение четырех недель. Глубина введения ректального зонда составляла около 1 см (рис. 1).

Таблица 1 / Table 1

Распределение животных по экспериментальным группам и применяемым к ним фармакологическим средствам (веществам)

The distribution of mice is due to experimental groups and administered pharmacological substances

Вещество / Substance	Группа / Groups
Вещество / Substance	Первая / 1^st	Вторая / 2^nd	Третья / 3^rd	Четвертая / 4^th	Пятая / 5^th	Шестая / 6^th
–	10	–	–	–	–	–
МНМ / NMU	–	10	–	–	–	–
МНМ + L-тироксин / NMU + L-thyroxin	–	–	20	–	–	–
МНМ + ПТУ / NMU + PTU	–	–	–	20	–	–
L-тироксин / L-thyroxin	–	–	–	–	20	–
ПТУ / PTU	–	–	–	–	–	20
Примечание. МНМ — метилнитрозомочевина; ПТУ — пропилтиоурацил. Note. The group 1 – control; the group 2 – NMU; the group 3 – NMU + L-thyroxin; the group 4 – NMU + PTU; the group 5 – L-thyroxin; the group 6 – PTU.

Рис. 1. Введение нитрозометилмочевины ректальным катетером

Fig. 1. Administration of methylnitrosourea by rectal catheter

Фокусы аберрантных крипт регистрировали по следующей схеме: животных из всех групп, включая контроль, подвергали цервикальной дислокации на 20-й неделе эксперимента. Далее ex tempo выделяли кишечник, промывали фосфатно-солевым буфером ФСБ для освобождения от каловых масс, выделяли прямую кишку с прилежащим участком, вырезали, разрезали продольно и слизистой оболочкой вверх помещали на предметное стекло. Далее наносили 0,2 % раствор метиленового синего, приготовленного на ФСБ, и регистрировали ФАК на световом микроскопе при увеличении ×400 (об. 10, ок. 40). Подсчитывали частоту ФАК для каждого животного и выражали в процентах. Статистическую обработку результатов проводили по t-критерию Стьюдента.

Для анализа микробиоты кишечника в начале эксперимента и перед выведением животных из эксперимента от каждой группы животных собирали фекалии, после чего анализировали количественный состав микробиоты. Для выделения ДНК в пробирку объемом 2 мл помещали 0,2 г фекалий. Добавляли равное по объему количество шариков диаметром 0,1 мм (BioSpec, США), 350 мкл раствора А (натрий-фосфатный буфер — 20 мМ, изотиоцианат гуанидина — 240 мМ; рН 7,0), 350 мкл раствора Б (Трис-HСl — 500 мМ, SDS — 1 % по массе к объему; рН 7,0) и 400 мкл смеси фенол–хлороформ. Пробирку помещали в гомогенизатор (Bertin Technologies) и разрушали образец в течение 10–15 мин. Затем центрифугировали при 10 000–15 000 об. в течение 5 мин. Водную фазу отбирали, добавляли 400 мкл хлороформа, интенсивно встряхивали 1–3 мин, центрифугировали так же, как на предыдущей стадии, отбирали водную фазу. К неочищенному экстракту ДНК добавляли один объем изопропилового спирта, интенсивно встряхивали, центрифугировали, промывали 70 % этанолом, слегка подсушивали на воздухе и растворяли осадок при 65 °С в течение 15 мин в 100 мкл воды. Для очистки ДНК от примесей проводили электрофорез в 1 % агарозе (0,5× ТАЕ-буфер). Вырезанный блок, содержащий ДНК, помещали в пробирку типа эппендорф (1,5 мл), добавляли два объема раствора В (изотиоцианат гуанидина — 3 М, Трис-HСl — 20 мМ, Тритон Х-100 — 20 мг/мл; рН 7,0) и инкубировали при 65 ºС до полного растворения блока. К раствору добавляли 20 мкл раствора Г (раствор В с добавлением тонкодисперсной окиси кремния, 40 мг/мл), перемешивали и инкубировали 5 мин при комнатной температуре, периодически встряхивая. Затем центрифугировали при максимальной скорости, полностью убирали супернатант, осадок суспендировали в 200 мкл раствора Д (этанол — 25 %, изопропанол — 25 %, NaCl — 100 мМ, Трис-HСl — 10 мМ; рН 7,0), центрифугировали, полностью отбирали супернатант, осадок ресуспендировали в этаноле, опять центрифугировали и полностью удаляли супернатант. Осадок подсушивали на воздухе в течение 15 мин, добавляли 50 мкл элюирующего буфера (Трис-HСl — 10 мМ, EDTA — 1 мМ; рН 8,0) и элюировали на вортексе в течение 20–30 мин. После этого образцы центрифугировали и отбирали супернатант, избегая попадания окиси кремния в очищенный препарат ДНК. При конструировании и секвенировании ампликонных библиотек очищенный препарат ДНК (по 10–15 нг) использовали в качестве матрицы в реакции ПЦР (температурный профиль: 94 °С — 30 с, 56 °С — 30 с, 72 °С — 60 с; всего 25 циклов) с добавлением полимеразы Encyclo («Евроген», Россия) и универсальных праймеров к вариабельному участка гена V3 гена Lactobacillus 357f (CCTACGGGAGGCAGCAG) и 519r (ATTACCGCGGCKGCTGG).

Результаты

В среднем масса животных по группам к моменту выведения из эксперимента достоверно не отличалась и составляла в среднем 22 г. Как следует из полученных результатов (см. табл. 2), частота ФАК была наиболее высокой в группе животных, получавших как МНМ, так и L-тироксин. Было выявлено достоверное отличие по отношению ко всем исследуемым группам: по отношению к группам 1, 3, 4, 5 и 6 при р < 0,001, тогда как по отношению к группе 2, животные которой получали только МНМ, различия были зарегистрированы и значимы при р < 0,01. При этом группа контроля и группа, которая получала антигормональный препарат, не отличались достоверно по частоте возникновения ФАК. Интересно отметить, что группа, которая получала МНМ и ПТУ, также достоверно не отличалась по частоте ФАК от группы, получавшей только гормональный препарат. Причем у отдельных животных первой, контрольной группы, которые не получали никаких субстанций, также присутствовали единичные ФАК в слизистой оболочке прямой кишки (рис. 2). Такие же наблюдения были сделаны для остальных групп мышей. Напротив, в слизистой прямой кишки у ряда мышей из группы 3 в единичных случаях регистрировались множественные ФАК (рис. 3). Как правило, размер ФАК варьировал в пределах 0,1–0,3 мм.

Таблица 2 / Table 2

Частота фокусов аберрантных крипт (%) в слизистой прямой кишки

The frequency of foci of aberrant crypts (%) in rectal mucosa

Группы / Control	Вещества / Substances
Группы / Control	Контроль / Control	МНМ / NMU	МНМ + L-тироксин / NMU + L-thyroxin	МНМ + ПТУ / NMU + PTU	L-тироксин / L-thyroxin	ПТУ / PTU
Первая / 1^st	3,1 ± 1,5	–	–	–	–	–
Вторая / 2^nd	–	25,3 ± 4,8	–	–	–	–
Третья / 3^rd	–	–	38,9 ± 3,6	–	–	–
Четвертая / 4^th	–	–	–	16,1 ± 2,5	–	–
Пятая / 5^th	–	–	–	–	12,9 ± 4,2	–
Шестая / 6^th	–	–	–	–	–	2,8 ± 0,9
Примечание. МНМ — метилнитрозомочевина; ПТУ — пропилтиоурацил. Note. NMU – methylnitrosourea, PTU – propylthiouracyli.

Рис. 2. Фокусы аберрантных крипт в слизистой прямой кишки: а — нормальная слизистая; b, c, d — фокусы аберрантных крипт указаны стрелками. Увеличение ×400

Fig. 2. Foci of aberrant crypts in rectal mucosa: а – normal rectal mucosa; b, c, d – foci of aberrant crypts indicated by arrows. Magnification ×400

Рис. 3. Множественные фокусы аберрантных крипт в слизистой прямой кишки мыши, получавшей МНМ и L-тироксин. Увеличение ×400

Fig. 3. Multiple foci of aberrant crypts in rectal mucosa of mice administered to methylnitrosourea and L-thyroxin. Magnification ×400

Результаты анализа микробиоты кишечника исследуемых животных показывают, что к началу эксперимента количественный показатель вида Lactobacillus соответствовал норме [19]. Поскольку группа 6 показала соответствие группе 1 как до начала эксперимента, так и по его окончании, то результаты не приведены. После воздействия субстанций в количественном распределении бактерий вида Lactobacillus (Lactobacillus spp.) в кишечнике мышей произошли определенные изменения (рис. 4, 5). Было зарегистрировано существенное количественное снижение Lactobacillus spp. в группах 2, 3 и 5 не только по отношению к контролю, но к остальным группам (p < 0,05). Интересно отметить, что между остальными группами по количественному изменению Lactobacillus spp. в кишечнике исследуемых мышей достоверных различий обнаружить не удалось.

Рис. 4. Тотальная ДНК. М — маркер; 1 — группа 1; 2 — группа 2; 3 — группа 3; 4 — группа 4; 5 — группа 5

Fig. 4. Total DNA. M – marker; 1 – group 1; 2 – group 2; 3 – group 3; 4 – group 4; 5 – group 5

Рис. 5. Полимеразная цепная реакция. М — маркер; 1 — группа 1; 2 — группа 2; 3 — группа 3; 4 — группа 4; 5 — группа 5

Fig. 5. PCR. M – marker; 1 – group 1; 2 – group 2; 3 – group 3; 4 – group 4; 5 – group 5

Обсуждение

Ранее нами было показано, что гипертиреоидное состояние является фактором риска для развития опухоли молочной железы в эксперименте. Так, на мышах линии C3H-A было выявлено, что при экспериментально измененном тиреоидном статусе в группе самок, получавших L-тироксин, частота возникновения опухоли молочной железы была выше, а выживаемость ниже. При этом в группе животных, получавших пропилтиоурацил, частота возникновения опухоли молочной железы была даже ниже, чем в контроле, хотя значимых различий обнаружено не было [4]. К настоящему времени уже получено достаточное количество убедительных данных, свидетельствующих, что гипертиреоидное состояние служит фактором риска у женщин для развития не только рака молочной железы, но и яичника [1, 3, 5]. Поэтому гипертиреоз можно уверенно использовать как прогностический маркер в онкологической клинике [2]. В нашем исследовании было продемонстрировано, что при гипертиреоидном статусе частота ФАК достоверно выше как по сравнению с контролем, так и по сравнению с группой мышей, получавших ПТУ (см. табл. 2). Это согласуется с данными проспективного исследования пациентов с гипертиреозом. У таких пациентов наблюдалась тенденция к более высокому риску возникновения колоректального рака по сравнению с пациентами, у которых уровень тиреоидных гормонов был в норме. В данном исследовании было установлено, что гипотиреоидное состояние обусловливает антиопухолевый эффект [18]. Воздействие МНМ на фоне приема ПТУ существенно снижало частоту ФАК по сравнению, прежде всего, с группой, получавшей как МНМ, так и L-тироксин, где частота ФАК была наиболее высокой (см. результаты). Это говорит о защитном влиянии гипотиреоидного состояния на частоту возникновения ФАК, а возможно, на возникновение впоследствии и колоректального рака. Несмотря на достигнутые успехи в изучении механизмов, которые приводят к данной патологии, занимающей одно из ведущих мест в смертности от онкологических заболеваний, многое остается неясным. Обнаружены ассоциации между риском возникновения колоректального рака и определенными изменениями микробиома [35]. Так, например, при анализе микробиома у крыс с высокой частотой ФАК были выявлены достоверные изменения в составе микробиома по сравнению с крысами, у которых частота ФАК соответствовала референсным значениям. В группе с высокой частотой возникновения ФАК отмечалась тенденция к снижению Lactobacillus spp. [36]. Полученные в нашем исследовании результаты о снижении количества Lactobacillus spp., которые являются представителями нормальной микрофлоры кишечника [6], могут указывать на защитное влияние Lactobacillus spp. по отношению к эпителию кишечника посредством метаболома [12]. Тогда как повышенный уровень тиреоидных гормонов и самой МНМ может обусловливать снижение количества, а возможно, и изменение качественного состава Lactobacillus spp. микробиома, как, впрочем, и других представителей нормальной микрофлоры и способствовать возникновению ФАК, а в дальнейшем и собственно колоректального рака [11]. В эксперименте было установлено, что использование пробиотика на основе Lactobacillus spp. (Lactobacillus acidophilus и Lactobacillus rhamnosus) существенно снижало риск возникновения ФАК у мышей [22].

Выводы

Повышенная частота возникновения фокусов аберрантных крипт и уменьшение количества представителей нормальной микробиоты ассоциировано с гипертиреозом, который модулируется введением метилнитрозомочевины.

About the authors