Features of sample preparation with the use of immunomagnetic sorbent when studying field material for plague agent

Full Text

Проблематика борьбы с инфекцион- ными болезнями сохраняет актуальность в связи с растущими региональными и глобальными интеграционными процессами, либерализацией торговли, ростом трансграничного перемещения людей. В ряде стран обострилась эпидемиологическая ситуация по чуме, появляются новые патогены, а известные инфекции в силу ряда факторов распространяются на новые территории и меняют свои эпидемиологические свойства. В условиях взаимосвязанного и взаимозависимого мира все это продолжает угрожать здоровью населения, создавая риски санитарно-эпидемиологическому благополучию и биологической безопасности регионов. Сегодня любая вспышка инфекционного заболевания способна в считанные дни перерасти в глобальную угрозу [2]. Мониторинг инфекционных болезней является одной из наиболее важных составляющих комплекса мер по предотвращению и борьбе с эпидемиями. Для успешного решения этой задачи необходимо постоянно поддерживать высокий уровень иммунобиологических технологий [4, 6], среди которых особая роль принадлежит экспрессным методам диагностики, адаптированным для прямого исследования разнообразных потенциально инфицированных объектов биотической и абиотической природы. В связи с необходимостью методического совершенствования подготовки проб объектов окружающей среды для эффективной детекции возбудителей особо опасных инфекций актуальным направлением научных исследований является разработка способов применения магнитных сорбентов, обеспечивающих избирательное концентрирование и очистку проб от возможной контаминации посторонней микрофлорой [9]. Несмотря на меры общественного здравоохранения, направленные на искоренение чумы, заболевание сохраняется в некоторых странах и даже возрождается [10]. Многие годы свойство штаммов возбудителя чумы продуцировать капсульный антиген F1 относили к основным детерминантам его вирулентности. Его выявление служило подтверждением принадлежности исследуемых бактерий к виду Y. pestis. Однако в некоторых эндемичных очагах удалось обнаружить штаммы с нарушенной продукцией капсульного антигена, которые вызывают у чувствительных к ним организмов не острое заболевание чумой, а ее «подострую» форму, которая характеризуется затяжным инфекционным процессом, инкубационным периодом или даже вялым скрытым течением. Штаммы, которые синтезируют, но не секретируют капсульный антиген, были выделены от больных людей. С одной стороны, это подтверждает их опасность, а с другой - затрудняет детекцию и идентификацию, поскольку основные усилия и приемы диагностики направлены в основном на выявление капсульного антигена [1, 3]. Возбудитель чумы по своим биологическим свойствам отнесен к высшей категории «А» среди наиболее опасных патогенных микроорганизмов - потенциальных агентов биологического оружия. Существует также угроза биотеррористических актов, приводящих к преднамеренному распространению Y. pestis в окружающей среде [5, 11]. Поэтому остается актуальным расширение арсенала препаратов для экспрессных методов детекции типичных и измененных в антигенном отношении штаммов чумного микроба. Цель исследования Разработка технологии пробоподготовки при исследовании полевого материала на наличие возбудителя чумы с использованием иммуномагнитного сорбента для выявления типичных и дефектных по синтезу антигена F1 штаммов Y. pestis. Материал и методы При выполнении работы использованы 27 штаммов микроорганизмов I-IV групп патогенности разных родов и видов. Для получения поливалентной чумной гипериммунной сыворотки использовали разработанную авторами статьи схему иммунизации с тималином и циклофосфаном. Схема основана на подборе оптимальной антигенной композиции: капсульный антиген F1, белково-липополисахаридный комплекс (БЛП) и водно-солевой экстракт, в котором, по мнению ряда исследователей, обнаруживаются в тех или иных количествах все выявленные у чумного микроба антигены [7, 9]. Конъюгацию полученных иммуноглобулинов G (IgG) с индикаторным ферментом - пероксидазой хрена (тип VI-А, Rz: ~3.0 с активностью 1550 units/mg (Sigma) проводили по методу перйодатного окисления. Для подтверждения воспроизводимости и достоверности полученных при исследовании результатов проводили математическую обработку результатов экспериментов в программе EXCEL, производя расчет значения средней квадратичной ошибки отдельного измерения, выборочной дисперсии, вероятного квадратичного отклонения при двух степенях свободы с доверительной вероятностью 0,95. К настоящему времени разработан стандартный образец магносорбента (СО 007-9388-2015), на его основе был сконструирован иммуноглобулиновый чумной магноиммуносорбент (МИС) [8]. Для оценки специфической активности и специфичности было изготовлено семь экспериментальных серий МИС. Результаты и обсуждение Оценка чувствительности полученных МИС в лабораторных условиях была проведена на чистых культурах возбудителя чумы, типичных и дефектных по синтезу F1. Изучение специфичности МИС проведено на штаммах гетерологичных микроорганизмов: Y. enterocolitica (4 штамма), Y. pseudotuberculosis (6 штаммов), Escherichia (E.) coli (3 штамма), Salmonella (S.) typhimurium (2 штамма). Результаты исследований представлены в таблице. При проведении иммуноферментного анализа (ИФА) с предварительной пробоподготовкой на МИС удалось обнаружить фракционные и дефектные по синтезу F1 штаммы чумного микроба в концентрации, равной разведению 10-7-10-6 (1,0ґ102 - 1,0ґ103 м.к./мл). Все изготовленные серии МИС не выявляли в ИФА гетерологичные штаммы в концентрации, равной разведению 10-4 (1,0ґ105 м.к./мл) и выше. Возможность детекции чумного микроба и его антигенов в объектах окружающей среды при помощи разработанного МИС осуществляли путем изучения искусственно контаминированных проб (почва, погадки хищных птиц) и полевого материала (блохи грызунов). Исследования свидетельствовали, что в искусственно инфицированных пробах почвы и погадок удавалось обнаружить типичные и дефектные по синтезу антигена F1 штаммы Y. pestis в концентрации, равной разведению, не менее 10-6 (1,0ґ103 м.к./мл), при этом гетерологичные микроорганизмы не были выявлены. Исследования в полевых условиях проводили в Центрально-Кавказском природном очаге чумы на базе Эльбрусского отряда Кабардино-Балкарской противочумной станции Роспотребнадзора. Детекцию чумного микроба проводили при исследовании блох Citellophilus tesquorum, собранных с каждого грызуна или из одной норы. Объединенные в пулы, от нескольких особей до 20 блох, заливали 3% формалином так, чтобы его избыток составлял примерно 2 мл, и растирали пестиком в фарфоровой ступке. После отстаивания не менее 3 ч отбирали надосадочную жидкость и проводили селективное концентрирование на МИС. В каждую пробу вносили 50 мкл 10% взвеси МИС и инкубировали при температуре 37 °С в течение 30-40 мин. Далее жидкость из емкостей с исследуемыми пробами удаляли, придерживая МИС постоянным магнитом, далее с помощью дозатора полуавтоматического переносили МИС в пробирки типа Eppendorf, промывали шесть раз фосфатно-солевым буферным раствором с добавлением неионного детергента Твин 20 и проводили ИФА. Антиген возбудителя чумы был обнаружен в трех пробах. В этих же образцах получен положительный результат при исследовании эктопаразитов молекулярно-генетическим методом, используя набор реагентов для выявления ДНК Y. pestis в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс Yersinia pestis-FL». Для исключения ложноположительных результатов при исследовании эктопаразитов были проведены экспериментальные исследования в реакции МИС +ИФА имаго пивших блох Citellophilus tesquorum и Xenopsylla cheopis, полученных из инсектария лаборатории медицинской паразитологии Ставропольского научно-исследовательского противочумного института Роспотребнадзора. Положительно реагирующих проб блох выявлено не было. Для удобства использования в полевых условиях был сконструирован экспериментальный набор реагентов тест-системы иммуноферментной магноиммуносорбентной для выявления типичных и дефектных по синтезу F1 штаммов Y. pestis, который рассчитан на проведение качественного экспресс-анализа в дубликатах 36 неизвестных и двух контрольных образцов, всего 76 определений, для выдачи предварительного ответа. Заключение Предложенный способ пробоподготовки, осуществляемой путем избирательного концентрирования на МИС, имеет преимущество, позволяющее быстро и легко обнаруживать Y. pestis в образцах окружающей среды и эктопаразитах грызунов (блохах), одновременное выявление типичных и дефектных по синтезу F1 штаммов чумного микроба в ИФА. Это может иметь большое значение при эпидемиологическом обследовании очагов чумы, т. к. дает возможность обнаружения естественных или генетически модифицированных штаммов Y. pestis с отрицательным и/или положительным выражением F1 в образцах окружающей среды.

About the authors

I. S Tyumentseva

Email: labdiagn@yandex.ru

S. A Kurcheva

E. N Afanasev

I. V Zharnikova

E. V Zhdanova

O. L Startseva

Yu. Yu Garkusha

A. A Semircheva

References

Supplementary files