Assessing the possibility of differentiation of virulent and avirulent strains of Yersinia pestis by the polymerase chain reaction

Abstract

The results of developing a method of express differentiation of virulent and avirulent strains of Yersinia pestis. Experimentally demonstrated the possibility of using the polymerase chain reaction to identify virulent and avirulent strains of Yersinia pestis by the presence or absence of the genes that determine the synthesis of one of the leading factors of pathogenicity of Yersinia pestis - a sign of pigment sorbtion.

Full Text

При ликвидации чрезвычайным ситуаций адекватного решения важно иметь достоверв очагах инфекционным заболеваний и на био- ную экспресс-информацию об эпидемической логически опасных объектах для принятия значимости штаммов, вызвавших появление «(Военно-медицинский журнал», 10’2014 71 КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ болезней. При обнаружении возбудителя чумы на территории очага заболевания проводится комплекс карантинныж мероприятий. Для установления степени вирулентности вышвленным штаммов возбудителя чумы необходимо проведение полного комплекса лабораторным исследований, что является довольно длительным и трудоемким процессом. В настоящем исследовании решалась задача разработки методики, обеспечивающей экспрессное дифференцирование вирулентным и авирулентных штаммов чумного микроба с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР-анализ включает выделение ДНК из исследуемых проб материала, амплификацию фрагментов ДНК и детекцию продуктов ПЦР методом гель-электрофореза. Для специфической индикации возбудителя чумы в микробных культурах и в пробах из объектов внешней среды используется «Тест-система для обнаружения и идентификации возбудителя чумы (Y pestis) методом ПЦР», разработанная в Научно-исследовательском центре 33 ЦНИИИ МО РФ. Совместно с другими индикационными средствами она входит в укладку «Комплект приборов биологического контроля КПБК-1У» для проведения в полевых условиях экспрессной индикации и идентификации возбудителей особо опасным инфекционным заболеваний бактериальной природы с помощью ПЦР. В основу указанной тест-системы заложено использование метода мультилокусной ПЦР и выявление генетических детерминант, характерных для чумного микроба. Несмотря на высокую чувствительность и специфичность, она не позволяет дифференцировать вирулентные и авирулентные (вакцинные) штаммы Y. pestis, что затрудняет правильную оценку эпидемической значимости вышвленного микроорганизма. Используемые в настоящее время вакцинные штаммы чумного микроба были получены путем длительной его аттенуации (ослабления) по признакам, определяющим вирулентный фенотип, в т. ч. по признаку пигментсорбции. Эти штаммы относительно доступны для приобретения, что создает реальные предпосыики для их возможного использования с целью биотерроризма. Для оценки возможности дифференцирования вирулентным и авирулентным штаммов Y. pestis с помощью ПЦР быт проведен компьютерный анализ нуклеотидным последовательностей генома возбудителя чумы. По нашему мнению, целесообразно быио остановить выбор на генетической области, связанной с транспортом железа и пигментсорбции. При этом учитывалось, что способность бактерий Y pestis сорбировать гемин на поверхности микробным клеток относится к ведущим факто рам патогенности возбудителя чумы, влияющим как на образование блока преджелудка блох, так и на приживаемость бактерий в организме переносчиков и эффективность их трансмиссии. Кроме того, мы руководствовались тем, что у всех авирулентным и вакцинным штаммов чумного микроба данныш признак, как правило, фенотипически отсутствует. С использованием компьютерной программы «Oligo 4.0» были сконструированы олигонуклеотидные праймеры, фланкирующие фрагменты генов пигментсорбции Y. pestis, а затем проведен их химический синтез. В ходе дальнейшей работы с помощью ПЦР были исследованы препараты ДНК, выделенные из ряда вирулентным и авирулентным штаммов, в т. ч. вакцинного штамма EV линии НИИЭГ чумного микроба. В результате быии получены данные, свидетельствующие о наличии в геноме вирулентных штаммов Y. pestis анализируемых локусов пигментсорбции. При исследовании в ПЦР препаратов ДНК, выделенным из клеток ряда авирулентным штаммов чумного микроба, наблюдали образование амплифи-катов больших размеров, чем расчетные. В то же время при проведении ПЦР с ДНК вакцинного штамма ЕV НИИЭГ по двум локу-сам пигментсорбции синтез специфических амплификатов отсутствовал. Анализ этих данным позволяет сделать предположение о наличии в геноме исследованных авирулентных штаммов чумного микроба выфаженным структурным перестроек в опероне пигментсорбции, связанных с включением в него дополнительного генетического материала. В случае вакцинного штамма ЕV НИИЭГ чумного микроба, очевидно, произошла утрата области транспорта железа и пигментсорбции. Таким образом, экспериментально показана возможность дифференцирования с помощью полимеразной цепной реакции вирулентных и авирулентным штаммов Y. pestis по наличию или отсутствию в микробных клетках генов, детерминирующих синтез одного из ведущих факторов патогенности возбудителя чумы - признак пигментсорбции. Предлагаемый способ дифференциации позволяет получить предварительные данные, и для выдачи окончательного заключения о степени вирулентности штаммов чумного микроба необходимо проведение всего комплекса диагностических исследований, включая постановку биопробы на лабораторным животным. Особую ценность данный индикационный подход приобретает при расследовании возможным актов биотерроризма, когда применение авирулентным (вакцинным) штаммов возбудителей опасным и особо опасным инфекционным заболеваний представляется вероятным. 72