Use of bone marrow aspirate concentrate in the treatment of early stages of osteonecrosis of the femoral head

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Асептический некроз головки бедренной кости (АНГБК) – тяжелое, быстро прогрессирующее заболевание, приводящее к коллапсу головки, развитию вторичного остеоартрита и, как следствие, эндопротезированию тазобедренного сустава, включая и пациентов молодого возраста [1]. В то же время имеются убедительные доказательства, что выявление АНГБК на ранних стадиях и своевременно начатое лечение позволяет отсрочить, а в ряде случаев избежать радикального оперативного вмешательства [2]. Основой лечения в настоящее время является разгрузка сустава, медикаментозная терапия в комбинации с последующей туннелизацией головки и шейки бедренной кости [3]. Дополнительное локальное использование ортобиологических методик и клеточных технологий, таких как применение концентрата аспирата костного мозга, повышают эффективность лечения [4, 5, 6, 7]. Улучшение результатов лечения в этих случаях связывают с тем, что компоненты аспирата костного мозга способны стимулировать регенерацию костей и усиливать местный ангиогенез [8]. Однако используемый нативный аспират костного мозга, как источник мультипотентных стромальных клеток, различных факторов роста и цитокинов [8], содержит их в малых количествах. Увеличение содержания остеопрогениторных клеток в единице объема достигается за счет удаления фракции эритроцитов и части плазмы в процессе центрифугирования.

В настоящее время   спектр устройств и систем, используемых для сбора и обработки, аспирата костного мозга, очень широкий. Однако имеются данные, что клеточный состав концентрата может меняться в зависимости от выбора той или иной методики, что в конечном счете влияет на исход лечения [9, 10].

В этой связи разработка метода, способного максимально увеличить концентрацию ядросодержащих клеток-предшественников остается актуальной.  

 

Цель работы: разработать простой и быстрый способ получения концентрата аспирата костного мозга для повышения эффективности лечения пациентов с ранними стадиями асептического некроза головки бедренной кости.

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Процедура получения и применения концентрата аспирата костного мозга у пациентов с АНГБК была одобрена Комитетом по этике ФГБУ НМИЦ ТО им. Н.Н. Приорова. Письменное добровольное информированное согласие было получено от всех лиц, которые участвовали в этом исследовании, до операции.

 

Дизайн исследования

 

Одноцентровое проспективное наблюдательное не сравнительное исследование.

 

Критерии включения:

• Асептический некроз головки бедренной кости I-IIIA стадии по ARCO, подтвержденный данными КТ и МРТ
• Возраст 18-59 лет
• Болевой синдром в области тазобедренного сустава
• Наличие подписанного информированного добровольного согласия

Критерии невключения:

• Асептический некроз головки бедренной кости IIIB или IV стадии по ARCO, подтвержденный данными КТ и МРТ
• Возраст до 18 или старше 59 лет
• Общее тяжелое состояние пациента, обусловлено соматической патологией
• Наличие в анамнезе перелома проксимального отдела бедренной кости, опухоли области тазобедренных суставов
• Другое хирургическое лечение области тазобедренных суставов в анамнезе, включая туннелизацию, костную пластику, имплантацию титана или остеотомию.

 

Характеристика пациентов

В период с ноября 2021 года по ноябрь 2023 года 35 пациентов (64 тазобедренных сустава) с ранними стадиями АНГБК проходили лечение с применением концентрата аспирата костного мозга, полученного по предлагаемой методике.      Характеристика пациентов, включенных в исследование представлена в таблице №1.

 

В таблице 1 представлены клинические данные пациентов, включенных в исследование.

Пол (мужчины/женщины):	29/6
Средний возраст:	35,2 лет (25–52 года)
Средний индекс массы тела (ИМТ)	28,3 (19-40)
Причина асептического некроза:
·         Первичный (идиопатический):	4 пациента (8 тазобедренных сустава)
·         Вторичный:	31 пациент (56 тазобедренных сустава)
§  Covid-19 в легкой форме	4 пациента (8 тазобедренных сустава)
§  Covid-19 в тяжелой форме	26 пациентов (46 тазобедренных сустава)
§  длительный прием глюкокортикостероидов в анамнезе в связи с лечением хронического заболевания.	1 пациент (2 тазобедренных сустава)
Сопутствующая патология:
·         гастроинтестинальная патология	5 пациентов (14,3 %)
·         патология сердечно-сосудистой системы	3 пациента в (8,6 %)
·         заболевания щитовидной железы	2 пациента (5,7 %)
·         псориаз	2 пациента (5,7 %)
·         нефрологическая патология	1 пациент (2,9 %)
·         кластерная головная боль	1 пациент (2,9 %)
Вредные привычки:
·         курение	10 пациентов (28,6 %)
·         употребление алкоголя более 70 г в неделю	12 пациентов (34,3 %)
Стадия АНГБК:
II по ARCO	44 тазобедренных сустава (68,8 %)
IIIA по ARCO	20 тазобедренных сустава (31,2 %)
Сторона поражения:
·         одностороннее	6 пациентов (17,1 %)
·         двустороннее	29 пациентов (82,9 %)

 

Таблица 1. Клиническая характеристика пациентов, включенных в исследование

 

Всем пациентам до операции проводилось консервативное лечение, включающее разгрузку сустава (ходьба на костылях), применение антикоагулянтов (ривароксабан 10 мг), препаратов кальция (карбонат кальция до 1000 мг в сутки), активных метаболитов витамина Д (альфакальцидол 0,75-1,0 мкг в сутки), антирезорбтивных препаратов (золедроновая кислота 5 мг внутривенно однократно). Хирургическое лечение в виде туннелизации с введением концентрата аспирата костного мозга проводилось всем пациентам в сроки от 2х до 4х недель от начала терапии.

 

Описание хирургической техники получения аспирата и приготовления концентрата костного мозга из крыла подвздошной кости

 

Расходный материал, необходимый для выполнения процедуры представлен в таблице №2. и на рисунке№1  

 

Расходный материал, необходимый для выполнения процедуры	количество
Игла для трепанобиопсии G9 х 100 мм	1 шт.
Пробирки стерильные 50 мл (из ультрачистого первичного полипропилена, с крышкой из полиэтилена высокой плотности, апирогенные, не содержащие РНКаз и ДНКаз, для однократного применения)	2 шт.
Шприцы стерильные 50 мл  Луер Лок / Luer Lock    Или 30 мл	2 шт.     4 шт.
Шприцы стерильные 20 мл	6 шт.
Шприцы стерильные 10 мл	3 шт.
Игла 18G / 1,30 х 88 мм	4 шт.
Игла 21G / 0,80 х 120 мм	4 шт.
Скальпель игольчатый	1 шт.
Ножницы	1 шт.
Корнцанг прямой	1 шт.
Салфетки стерильные	10 шт.
Раствор для обработки операционного поля	100 мл
Белье стерильное для ограничения операционного поля	1 шт.
Гепарин 5000 МЕ/мл (5 мл)	5 амп.

 

Таблица 2. Расходный материал, необходимый для выполнения процедуры забора аспирата и приготовления концентрата костного мозга

 

 

Рисунок 1. Хирургический стол с расходным материалом, необходимым для выполнения забора и приготовления концентрата аспирата костного мозга

 

Figure 1. Surgical table with consumables required for collecting and preparing bone marrow aspirate concentrate

 

Положение пациента и техника аспирации костного мозга

 

В положении пациента лежа на животе, как показано на рисунке №2, для доступа к заднему верхнему гребню подвздошной кости под седацией опиоидным анальгетиком фентанилом (его дозировка определяется врачом анестезиологом) первым этапом производится пальпация костных ориентиров: верхняя задняя ость подвздошной кости, гребень подвздошной кости и крестцово-подвздошное сочленение (Рис.2a,b).

Далее после трехкратной обработки операционного поля выполняется местная анестезия кожи, подкожной жировой клетчатки, надкостницы (верхней задней ости подвздошной кости) в проекции вмешательства (Рис.2b) раствором 0,5 % ропивакаина 20 мл с 1 мл 0,01% раствора адреналина (Рис.2c).  Шприц для забора костного мозга заполняется раствором гепарина в расчете 500 ЕД на 1 мл костного мозга, что позволяет избежать образования тромбов и коагуляции (Рис.2d). Так же гепарином перед введением промывают иглу для трепанбиопсии.

Игольчатым скальпелем выполняется разрез кожных покровов длиной 3-5 мм (Рис.2e), через который вводят иглу для аспирации костного мозга до тех пор, пока она не достигнет верхней задней ости подвздошной кости (Рис.2f). Затем, приложив физическую силу, игла для аспирации костного мозга проходит через плотный кортикальный слой кости в костномозговую полость заднего гребня подвздошной кости на глубину 2 см. Траектория иглы должна быть перпендикулярна задней верхней ости подвздошной кости. Шприц с гепарином присоединяется к игле для аспирации костного мозга и осуществляется забор костного мозга в объеме 100 мл (Рис2.g), обычно для этого необходимо два 50 мл шприца (Рис.2h). По завершении забора костного мозга накладывается асептическая повязка.

 

 

h

g

f

e

c

b

a

d

 

Рисунок 2. Техника аспирации костного мозга: а-разметка костных ориентиров заднего гребня подвздошной кости и крестцово-подвздошного сочленения, b - пальпации области будущего вмешательства, c – местная анестезия, d – шприцы с гепарином, e – разрез кожных покровов игольчатым скальпелем, f – введение иглы для трепанбиопсии в костномозговую полость заднего гребня подвздошной кости, g – аспирация костного мозга с помощью шприца 50 мл, h – 100 мл аспирированного костного мозга

 

 

Figure 2. Technique of bone marrow aspiration: a - marking of bone landmarks of the posterior iliac crest and sacroiliac joint, b - palpation of the area of ​​future intervention, c - local anesthesia, d - syringes with heparin, e - incision of the skin with a needle scalpel, f - insertion of a needle for trephine biopsy into the bone marrow cavity of the posterior iliac crest, g - aspiration of bone marrow with a 50 ml syringe, h - 100 ml of aspirated bone marrow

 

Приготовление концентрата аспирата костного мозга

Полученный нативный костный мозг из шприцов переносится в две пробирки для центрифугирования объемом по 50 мл (Рис. №3а) и 1 мл переносится в вакуумную пробирку для гематологического анализа с К3ЭДТА (трикалиевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты), с целью проведения количественной оценки полученного материала. Далее производится дробное центрифугирование на Центрифуге CM-6MT на 400g по 2 минуты от 2 до 6 раз с визуальным контролем до разделения на фракции с оседанием эритроцитов до уровня 25-30 мл (Рис. №3b) [11].

По завершении центрифугирования с использованием шприца и длинной иглы диаметром 18G со дна каждой пробирки удаляется осадок эритроцитов объемом 20-25 мл (Рис. №3c). Оставшийся материал центрифугируется на 1000g в течение 15 минут (Рис. №3d). После второго центрифугирования удаляется поверхностный слой плазмы из каждой пробирки шприцом с длинной иглой, не допуская аспирации осадка (Рис. №3е) Оставшийся концентрат аспирата костного мозга из пробирок собирают с помощью длинной иглы 18G в два 10-мл шприца в объеме 5-7 мл в каждый шприц (Рис. №3f)  и 1 мл переносится в вакуумную пробирку для гематологического анализа с К3ЭДТА, с целью проведения количественной оценки, полученного материала и сравнения с нативным костным мозгом.

 

 

Рисунок 3. Техника приготовления концентрата аспирата костного мозга: а – перенос костного мозга из шприца в специальные пробирки для центрифуги объемом по 50 мл, b – первое центрифугирование на 400g по 2 минуты от 2 до 6 раз, c – удаление осадка эритроцитов объемом 20-25 мл, d - центрифугирование на 1000g в течение 15 минут, e – удаление поверхностного слоя плазмы из каждой пробирки, f – сбор концентрата аспирата костного мозга в два 10-мл шприца

 

Figure 3. Technique for preparing bone marrow aspirate concentrate: a – transferring bone marrow from a syringe into special 50 ml centrifuge tubes, b – first centrifugation at 400g for 2 minutes 2 to 6 times, c – removing 20-25 ml of erythrocyte sediment, d – centrifugation at 1000g for 15 minutes, e – removing the surface layer of plasma from each tube, f – collecting bone marrow aspirate concentrate into two 10 ml syringes

 

Туннелизация головки и шейки бедренной кости с введением концентрата аспирата костного мозга в очаг остеонекроза

Пациенту под спинальной анестезией в положение лежа на боку на операционном столе, под контролем C-дуги путем чрескожного сверления с помощью спицы Киршнера и сверла диаметром 3,2 мм выполняется туннелизация веерообразно методом разнонаправленных сверлений. Далее выполняется введение иглы для трепанобиопсии длинной 150 мм через один из сформированных каналов в центр некротического участка и подготовленный концентрат аспирата костного мозга в объеме 3-5 мл медленно вводится в область остеонекроза под контролем C-дуги. Производится ушивание раны. При двустороннем процессе аналогичная процедура повторяется с противоположной стороны после переворачивания пациента и обработки операционного поля.  Положения пациента на боку исключает необходимость манипуляции электронно-оптическим преобразователем во время вмешательства, что позволяет выполнять операцию без ассистента, контролируя прохождение спицы и сверла в двух проекциях за счет ротации бедра. Однако необходимо соблюдать осторожность при выполнении манипуляции, так как имеется риск деформации инструмента при неаккуратном выполнении ротации за счет движения мягких тканей и мышц. Помимо этого, требуется дополнительное время для перекладывания (переворачивания) пациента и перестерелизацию операционного поля при двустороннем АНГБК . Манипуляцию возможно выполнять в положении пациента лежа на спине при фиксации нижних конечностей на тракционном столе в положении отведения бедра 20-30 градусов. Данное положение позволяет одномоментно выполнить туннелизацию с обеих сторон без проведения перестерелизации операционного поля, снижает риск деформации сверла при ротации бедра, но требует помощи ассистента для работы с электронно-оптическим преобразователем и контроля прохождения спицы и сверла в двух проекциях.

 

Гематологический анализ

Оценку эффективности способа концентрации аспирата костного мозга проводили в клинической лаборатории ФГБУ НМИЦ ТО им. Н.Н. Приорова путем подсчета клеточного состава аспирата костного мозга всех 35 пациентов до и после центрифугирования.

Аликвоты объемом 1 мл отбирали тонкой иглой после тщательного перемешивания материала и помещали их в пробирки с К3ЭДТА, после чего доставляли в лабораторию для анализа.

Подсчет клеток осуществляли на гематологическом анализаторе SYSMEX XT-2000i (Япония).

Эффективность способа концентрации аспирата костного мозга оценивали по показателям общего количества лейкоцитов (WBC), эритроцитов (RBC), тромбоцитов (PLT), а также количеству мононуклеарных клеток костного мозга (MNC) как суммы количества лимфоцитов (LYMPH) и моноцитов (MONO).

 

Методы оценки клинико-радиологических результатов комбинированного лечения АНГБК

Период наблюдения составлял 12 месяцев. Оценка функциональных результатов   по шкалам HHS и WOMAC, болевого синдрома -по шкале ВАШ, качества жизни -по SF-36, проводилась до операции и через 3, 6, 12 месяцев после хирургического лечения. Стадия и активность АНГБК оценивалась по данным МРТ обоих тазобедренных суставов (не менее 1,5 Тесла) до операции, через 3, 6, 12 месяцев и КТ тазобедренных суставов до операции, через 6, 12 месяцев.

 

Статистический анализ

Статистический анализ данных проводили в программе SPSS 2023. Данные на нормальность распределения проверяли с помощью критериев Колмагорова - Смирнова и Шапиро -Уилка.

В зависимости от распределения количественные данные представлены в виде M±SD (M — среднее значение, SD — стандартное отклонение) или Me [МКИ]

(Me — медиана, МКИ — межквартильный интервал). Достоверность различий между выборками оценивали, используя U-критерий Манна — Уитни. Значение p <0,05 считалось статистически значимым.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ

 

Гематологический анализ

В результате измерений были получены следующие данные (Рис. 4):

Рисунок 4. Медиана количества клеток в аспирате костного мозга до и после центрифугирования (синий столбик – до центрифугирования, красный столбик - после центрифугирования)

 

Figure 4. Median cell count in bone marrow aspirate before and after centrifugation (blue column – before centrifugation, red column – after centrifugation)

 

После центрифугирования отмечено увеличение количества клеток:

лейкоцитов – в 4,79 раз (до – 18,93 [12, 53;21, 52]*109/л, после – 90,61 [71, 87;126, 20]*109/л).

нейтрофилов – в 5,99 раз (до – 11,29 [7, 32;14, 39]*109/л, после – 58,53[41, 96;84, 06]*109/л).

мононуклеарных клеток – в 5,78 раз (до – 5,52[3, 34;5, 93]*109/л, после – 31,89[22, 65;45, 41]*109/л).

эритроцитов – в 1,36 раз (до – 4,05[3, 79;4, 28]*1012/л, после – 5,49[4, 04;6, 62]*1012/л).

тромбоцитов – в 6,43 раз (до – 184,00[147, 25;223, 0]*109/л, после – 1102,00[661, 5;1328, 75]*109/л).

Во всех случаях, включая эритроциты, количество клеток после центрифугирования было достоверно больше (Рис.5), чем в аспирате нативного костного мозга (р<0,001 U-критерий Манна — Уитни).

b

a

 

Рисунок 5. Препараты аспирата костного мозга до центрифугирования (а), после центрифугирования (b). Окраска по Романовскому- Гимзе, х200.

 

Figure 5. Bone marrow aspirate preparations before centrifugation (a), after centrifugation (b). Romanovsky-Giemsa staining, x200.

 

Оценка функциональных результатов.

 

HHS (Шкала Харриса)

Средний показатель HHS составил 62 ± 15 до операции и 79 ± 14 через 12 месяцев. Средний показатель HHS значительно улучшился после хирургического лечения с применением концентрата аспирата костного мозга (p = 0,0007; Рис. 6).

 

Рисунок 6. Оценка функции тазобедренного сустава до и через 12 месяцев после туннелизации с введением концентрата аспирата костного мозга по шкале Харриса HHS

 

Figure 6. Assessment of hip function before and 12 months after tunneling with the introduction of bone marrow aspirate concentrate according to the Harris hip score (HHS)

 

 

WOMAC - опросник (Western Ontario and McMaster Universities Arthrose index)

Средний показатель WOMAC составил 86 ± 38 до операции и 57 ± 37 через 12 месяцев. Средний показатель WOMAC значительно улучшился после хирургического лечения с применением концентрата аспирата костного мозга (p = 0,02; Рис.  7).

Рисунок 7. Оценка функции тазобедренного сустава до и через 12 месяцев после туннелизации с введением концентрата аспирата костного мозга по WOMAC

 

Figure 7. Assessment of hip function before and 12 months after tunneling with the introduction of bone marrow aspirate concentrate according to WOMAC

 

Оценка болевого синдрома

 

ВАШ (Визуальная аналоговая школа)

Оценка боли по ВАШ снизилась сразу после процедуры у всех  пациентов. Средняя оценка ВАШ составила 4,8 ± 1,3 до операции и 3,2 ± 1,6 через 12 месяцев. Оценка ВАШ значительно снизилась после хирургического лечения с применением концентрата аспирата костного мозга (p = 0,002; Рис. 8)

Рисунок 8. Оценка болевого синдрома по ВАШ до и через 12 месяцев после туннелизации с введением концентрата аспирата костного мозга

 

Figure 8. Assessment of pain syndrome according to VAS before and 12 months after tunneling with the introduction of bone marrow aspirate concentrate

 

Оценка качества жизни

 

SF-36 опросник (The Short Form-36)

Средний показатель качества жизни по SF-36 составил 79± 10 до операции и 88 ± 13 через 12 месяцев. Средний показатель SF-36 значительно улучшился после хирургического лечения с применением концентрата аспирата костного мозга (p = 0,02; Рис. 9).

 

Рисунок 9. Оценка качества жизни по SF-36 до и через 12 месяцев после туннелизации с введением концентрата аспирата костного мозга

 

Figure 9. Quality of life assessment according to SF-36 before and 12 months after tunneling with administration of bone marrow aspirate concentrate

 

Рентгенологическое прогрессирование

Прогрессирование со II до IIIA стадию по ARCO наблюдалось в 4 тазобедренных суставах (4 пациента), с IIIA до IIIB стадию по ARCO в 5 тазобедренных суставах (4 пациента). Размер некротического очага не изменился между предоперационной оценкой и через 12 месяцев после операции во всех тазобедренных суставах. (Рис. 10)

Рисунок 10. Рентгенологическое прогрессирование стадии АНГБК по классификации ARCO после проведенного лечения

 

Figure 10. Radiographic progression of the ANFH stage according to the ARCO classification after treatment

 

Эндопротезирование тазобедренного сустава как исход лечения АНГБК

Тотальное эндопротезирование тазобедренного сустава потребовалось 4 пациентам (пять тазобедренных суставов, что составляет 7,7% от общего числа тазобедренных суставов у наблюдаемых пациентов). Показаниями к данному хирургическому вмешательству были коллапс суставной поверхности и продолжающаяся боль (ВАШ более 6 баллов).

У данных пациентов на момент туннелизации с введением концентрата аспирата костного мозга во всех случаях по результатам МРТ и КТ была IIIA (предколлапсная стадия) по ARCO. Среднее время до прогрессирования заболевания до IIIB стадии по ARCO и перехода на тотальное эндопротезирование составило 10,8 месяцев (от 8 до 12 месяцев). (Рис. 11)

 

 

Рисунок 11. Эндопротезирование тазобедренного сустава как исход лечения АНГБК в течение 12 месяцев после туннелизации с введением концентрата аспирата костного мозга

 

Figure 11. Hip replacement as an outcome of ANFH treatment within 12 months after tunneling with bone marrow aspirate concentrate

 

ОБСУЖДЕНИЕ

 

На фоне значительного улучшения функциональных результатов у пациентов по шкалам HHS и WOMAC, уменьшения болевого синдрома по ВАШ и улучшения качества жизни у пяти из шестидесяти четырех тазобедренных суставов потребовалось выполнение тотального эндопротезирования. Необходимость эндопротезирования была обусловлена прогрессированием заболевания до IIIB-IV стадии по ARCO и сохранением у пациентов постоянного болевого синдрома (ВАШ более 6) в течение 12-месячного периода наблюдения. Возможность такого исхода определялась тем, что туннелизация с введением концентрата аспирата костного мозга проводилась при IIIА стадий по ARCO.

Эти результаты согласуются с другими исследованиями, показывающими низкую эффективность и высокую вероятность прогрессирования заболевания на данной стадии [12].

 

В  настоящем исследовании  представлены результаты простой, быстрой и недорогой в исполнении техники приготовления аутологичного концентрата аспирата костного мозга и эффективности  его использования при туннелизации головки и шейки бедренной кости в комбинированном лечении пациентов с ранними стадиями АНГБК.

Важными параметрами для получения оптимальных результатов при использовании концентрата аспирата костного мозга считается его качественный и количественный состав, который зависит как от биологических характеристик каждого отдельного пациента, так и от места  и техники забора и метода его приготовления [13].

Что касается места забора костного мозга, мы ориентировались на данные литературы. Ранее Hyer et al. сравнивая концентрацию клеток, полученных из аспирата костного мозга переднего гребня подвздошной кости с аспиратами из дистального метафиза большеберцовой кости и тела пяточной кости, выявили что клеточный состав наибольший в гребне подвздошной кости [14].

В последующем превосходство гребня подвздошной кости   по количеству выделенных клеток в сравнении с бедренной и большеберцовой костью было подтверждено другими авторами [15, 16]. Pierini et al., которые при сравнении количества клеток, полученных из переднего и заднего гребня подвздошной кости, отметили  большее их количество при получении аспирата  из задней верхней ости подвздошной кости [17].

Следующим важным условием качества   концентрата является способ его приготовления из полученного нативного костного мозга. В настоящее время применяются различные устройства и системы для сбора и обработки аспирата костного мозга: ручные, полуавтоматические и автоматические методики центрифугирования (обычные центрифуги, полиэфирные гели, раствор Ficoll, система ВМАС Arthrex Angel, система афереза Spectra Optia и другие). Качество и количество, полученного концентрата аспирата костного мозга при использовании данных систем отличается друг от друга. Попытки сравнить между собой различные системы сбора и приготовления концентрата костного мозга   не выявили научно обоснованного превосходство какого-то одного устройства [18].

Предложенный нами способ позволяет получить пятикратный концентрат аспирата костного мозга с минимальными затратами времени (по сравнению с выделением на фиколле) и средств (по сравнению с коммерческими аналогами и системами выделения).

Общее количество ядерных клеток в нашем случае отражает показатель лейкоцитов, посчитанный на гематологическом анализаторе SYSMEX XT-2000i (Япония). Возможность их использования для этих целей     показана ранее: Sysmex XT-1800i   в исследовании Schäfer R с соавт [19] и ADVIA 120 в исследовании Hedge et.al. [10]. Выявленная нами разница в нативном костном мозге и концентрате по общему количеству клеток (лейкоциты) составляла 4,79, в то время как разница по количеству нейтрофилов и мононуклеарных клеток составила 5,99 и 5,78 соответственно. Причина таких различий полагаем в том, что гематологический анализатор считает общее и дифференцированное количество клеток разными способами: подсчет общего количества клеток проводится апертурно-импедансным методом, а дифференцированный подсчет – методом проточной цитометрии. Мы ориентировались на общее количество ядерных клеток, так как на этот показатель ссылается большинство исследователей [19, 20], а показатели количества нейтрофилов и мононуклеарных клеток использовали как дополнительные ориентиры.  Тем не менее не исключаем, что проблема валидации результатов исследования аспирата костного мозга на гематологических анализаторах может стать предметом отдельных исследований. Медиана общего количества ядерных клеток (лейкоцитов) до центрифугирования была равна 18,93*109/л, ее значение оказалось сопоставимо с данными других исследований [19, 20]. Некоторое снижение показателя относительно данных представленных рядом авторов [13, 19] связываем с более старшим возрастом пациентов в наблюдаемой нами группе. Связь возраста и концентрации клеток отмечена в исследовании, авторы которого [21] отметили, что у пациентов до 30 лет концентрат содержит в три раза большее количество ядросодержащих клеток, чем у пациентов старше 60 лет, при этом пол, раса, индекс массы тела и наличие остеопороза не влияли на концентрацию. Также не исключаем   связь более низкой концентрации клеток, оцениваемых в нашем исследовании с перенесенной большинством пациентов тяжелой коронавирусной инфекции и   кортикостероидной терапии.

Для ориентировочного расчета концентрации мультипотентных стромальных клеток в концентрате аспирата мы использовали данные, ранее полученные другими исследователями: мультипотентные стромальные клетки в нативном костном мозге составляют 0,01-0,02% от всех ядерных [13, 20, 22].

Эти данные получены путем подсчета КОЕ-Ф в культуре клеток.

 Исходя из того, что медиана количества лейкоцитов концентрата аспирата костного мозга составляла 90,61*109/л, предполагаемое количество мультипотентных стромальных клеток в 1 мл концентрата составило 9,06 – 18,12*103/мл (0,01-0,02%), т.е. 9060-18120 клеток в 1 мл. В нашем случае объем пятикратного концентрата, полученного из 100 мл, аспирата костного мозга, составлял 10 мл, что обеспечивало   достаточный объем для введения при двустороннем процессе в обе головки бедренной кости по 5 мл концентрата аспирата.

  Так как на 1 мл полученного нами концентрата приходилось 9060-18120 клеток, то в каждый очаг остеонекроза (в головку бедренной кости) вводилось по 45300 – 90600 клеток, содержащихся в 5 мл концентрата.

 Ранее отмечалась связь большого количества введенных клеток с хорошим исходом лечения асептического некроза [23].

Однако достаточная эффективная доза мультипотентных стромальных клеток костного мозга на данный момент не определена и остается предметом дискуссии [24].

Мы можем только предполагать пороговое значение дозы клеток в концентрате аспирата в зависимости от скорости ремоделирования кости и количества мезенхимальных клеток, присутствующих в нормальной головке бедренной кости. Известно, что общее количество мезенхимальных клеток в 1 см³ головки бедренной кости составляет в среднем 700 ± 264 на см³, поскольку головка бедренной кости имеет средний объем 50 см³, то всего присутствует 35 000 клеток. Это число можно рассматривать как целевое количество клеток, которое необходимо ввести в головку бедренной кости, чтобы восстановить то же количество клеток, что и в нормальной головке бедренной кости [25]. В недавнем крупном исследовании Hernigou et.al. выявлена значимая корреляция между количеством клеток и исходом лечения остеонекроза. При этом дозы клеток, введенные в очаг остеонекроза, составляли 117,000 ± 42,000 (от 45,000 до 301,000) при остеонекрозе 1 степени (190 пациентов), и 127,000 ± 39,000 (от 48,000 до 310,000) при остеонекрозе 2 степени (216 пациентов) [26]. Такое количество клеток сопоставимо с результатами при использовании нашей методики получения концентрата аспирата костного мозга. Однако важно отметить, что эффективность концентрата аспирата костного мозга, по-видимому, зависит не только от наличия и концентрации мультипотентных стромальных клеток [27].

Эффективность концентрата аспирата костного мозга связывают также с высокой концентрацией тромбоцитов, биоактивных молекул, факторов роста, цитокинов и хемокинов которые, как сообщается, обладают анаболическим и противовоспалительным действием [28, 29]. Как показал анализ исходов, использование концентрата аспирата костного мозга при АНГБК зависит от стадии заболевания. Эндопротезирование    5 из 64 суставов   через 12 месяцев после туннелизации с введением концентрата аспирата костного мозга выполнено пациентам, лечение которых начиналось   при IIIА стадий по ARCO. Возможность неблагоприятного исхода при выполнении туннелизации при IIIА и IIIВ стадий по ARCO отмечалась и другими исследователями [12].

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Таким образом, представленная простая, быстрая и недорогая в исполнении техника забора костного мозга и приготовления аутологичного концентрата аспирата костного мозга позволяет получить целевое количество клеток, которое необходимо ввести в головку бедренной кости, чтобы восстановить то же количество клеток, что и в нормальной головке бедренной кости.  Эффективность использования концентрата аспирата костного мозга доказана при ранней стадии АНГБК (II по ARCO), которую имели большинство   наблюдаемых нами пациентов.   При АНГБК IIIА стадии по ARCO   туннелизация с введением концентрата аспирата костного мозга может быть не эффективна и уже в течение первого года завершается эндопротезированием тазобедренного сустава. Оригинальность исследования и возможность ее применения в клинической практике на ранних стадиях АНГБК подтверждена   2-мя патентами [11, 30].

 

About the authors

Alexander Torgashin

National Medical Research Center of Traumatology and Orthopedics named after N.N. Priorov, Moscow, Russia

Author for correspondence.
Email: dr.torgashin@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-2789-6172
SPIN-code: 8749-3890
Russian Federation, 127299, Российская Федерация, Москва, ул. Приорова, 10

Alina Baikova

National Medical Research Center of Traumatology and Orthopedics named after N.N. Priorov, Moscow, Russia

Email: alinazakirova30@mail.ru
ORCID iD: 0009-0004-8986-7272
SPIN-code: 3382-2346
Russian Federation, 127299, Российская Федерация, Москва, ул. Приорова, 10

Sergey Alexandrovich Rodionov

National Medical Research Center of Traumatology and Orthopedics named after N.N. Priorov, Moscow, Russia

Email: rodionov_085@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4785-2940
SPIN-code: 6861-3133
Russian Federation, 127299, Российская Федерация, Москва, ул. Приорова, 10

Svetlana Semenovna Rodionova

National Medical Research Center of Traumatology and Orthopedics named after N.N. Priorov, Moscow, Russia

Email: rod06@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0002-2726-8758
Russian Federation, 127299, Российская Федерация, Москва, ул. Приорова, 10

References

Supplementary files