Modeling of a Different Volume Spinal Cord Injury in Rats and Methods for Evaluation of Lost Functions Restoration

Full Text

Введение Проблема регенерации спинного мозга при его повреждении и дефектах сегодня является одной из наиболее актуальных и требующих комплексного решения. Всевозможные микрохирургические операции, направленные на прямое сшивание прерванных концов спинного мозга или использование аутоневральной пластики, не приводят к желаемому эффекту, а именно к восстановлению проводимости путей спинного мозга. Попытки создания экспериментальной модели повреждения спинного мозга осуществлялись неоднократно. Ehrlich и Brieger в 1884 г. впервые показали, что сдавление брюшной аорты у кроликов в течение часа вызывает поражение серого вещества спинного мозга [1]. Известен метод моделирования травмы спинного мозга по Allen, при котором после предварительной анестезии у животных обнажают спинной мозг и травмируют его падающим предметом определенной массы [2]. В настоящее время наиболее широко применяются методики контузионного и компрессионного повреждения, а также хирургического пересечения, так как они позволяют добиться нарушения проведения нервных импульсов по спинному мозгу в полном объеме. Контузионная модель наиболее применима при необходимости изучения патофизиологии вторичного повреждения, так как она обеспечивает повреждения разной степени тяжести с соответствующими нарушениями двигательных и сенсорных функций при сохранении структурной целостности тканей. Для этой модели в последние годы было разработано несколько устройств, позволяющих контролировать объем повреждения с достаточно высокой точностью. Часто используется методика с использованием падающего груза, подразумевающая применение устройства New York University (NYU)/MASCIS или его аналогов, преимущество которой заключается в специальной системе оценки силы удара, а также характеристики поверхности спинного мозга при ударе, что позволяет более точно контролировать параметры повреждения [3]. Существуют и другие методики, в которых повреждение обнаженному участку спинного мозга наносится при помощи механического воздействия, контролируемого датчиками давления на ткани спинного мозга [4, 5]. Компрессионная модель имитирует устойчивое сдавление спинного мозга при сужении позвоночного канала. Для достижения компрессионного эффекта применяются хирургические клипсы с установленной силой компрессии, модифицированные пинцеты, а также устройства для контролируемой пневматической компрессии. Наиболее воспроизводимых результатов, по сравнению с методиками наложения клипс и сдавления спинного мозга специально приспособленным пинцетом, удается добиться при использовании пневматических устройств, которые обеспечивают достаточно высокую точность моделирования компрессионных повреждений и дают возможность контроля над биомеханическими параметрами повреждения (сила, скорость компрессии, степень смещения ткани и др.) [6, 7]. Недостатки описанных моделей заключаются в малодоступности устройств, обеспечивающих высокую воспроизводимость повреждения [8]. Кроме того, такие модели не позволяют оценивать повреждения спинного мозга с нарушением непрерывности его структуры. Из наиболее доступных моделей повреждения спинного мозга самыми распространенными являются модели хирургического повреждения, включающие полное пересечение, фокальную миелотомию, дорсальную или латеральную гемисекцию, резекцию и аспирационные нарушения целостности нервной ткани спинного мозга. Преимущество данных методов заключается в достоверном полном нарушении структурной непрерывности аксонов в зоне хирургического вмешательства, что крайне важно при исследовании регенерационных возможностей ткани спинного мозга, так как на практике такие повреждения имеют высокую вероятность. Кроме того, такие модели позволяют изучать механизмы, которые препятствуют регенерации нервной ткани центральной нервной системы в зоне механического повреждения. Также их применение дает возможность оценить степень последующих утраты и восстановления функций соответствующих путей проведения. Пересечение спинного мозга позволяет создать идеальные условия для изучения регенеративных процессов. Частичное пересечение включает фокальную миелотомию на уровне C4, с последующим применением поведенческих тестов на оценку координации движений передних конечностей у лабороторных крыс [9]. Одностороннее пересечение отдельно взятых спинальных путей проведения на одном уровне используется для исследования локомоторных и сенсорных нарушений, а также компенсаторного восстановления с помощью электромеханического тестирования [10]. Альтернатива одностороннему пересечению - более полное дорсо-вентральное или вентро-дорсальное пересечение [11]. Недавно разработанная экспериментальная установка «вибро-нож» (VibraKnife) позволяет с высокой точностью выполнять миелотомии и дорсальные гемисекции, которые вызывают строго определенные сенсомоторные нарушения [8, 12]. Однако высокая стоимость и малодоступность установки «вибро-нож» значительно ограничивают возможность ее применения. В данном исследовании была разработана новая модель дозированного повреждения спинного мозга лабораторных животных с целью стандартизации методики при изучении возможности регенерации спинного мозга. Также был разработан оригинальный инструмент, который позволяет наносить точные повреждения спинного мозга лабораторных животных. Материал и методы Исследование проводилось на 80 лабораторных животных - самках крыс породы Вистар, весом 220 -260 грамм, разделённых на равные группы по 16 животных. Проведение эксперимента осуществлялось в соответствии с «Рекомендациями комитетам по этике, проводящим экспертизу биомедицинских исследований» (ВОЗ, 2000 г.) и «Директивами Европейского сообщества» (86-609 ЕЕС). Животные были разделены на 5 групп в зависимости от объёма повреждения: • I группа - 50% пересечение спинного мозга; • II группа - 80- 90% пересечение спинного мозга; • III группа - 100% пересечение спинного мозга (плотный контакт поврежденных концов спинного мозга); • IV группа - проводилась резекция сегмента спинного мозга длиной 1 см; • V группа - 100% пересечение с отсутствием контакта в зоне повреждения (концы спинного мозга в зоне повреждения разведены). Ход операции. Все операции осуществлялись одной хирургической бригадой с использованием оптического микроскопа Carl Zeiss и микрохирургического инструментария. Перед проведением операции животному вводился наркоз Золетил 100 в дозировке 0,1 мл, сбривался волосяной покров, подготавливалось рабочее операционное поле в области вмешательства. Разрез кожи осуществлялся в проекции остистых отростков позвонков в грудном отделе позвоночника от Th6-Th8 с помощью скальпеля, доступ к позвоночнику - с помощью микрохирургических ножниц. Необходимый уровень оперативного вмешательства определялся пальпаторно по соответствующим ребрам. Кусачками проводилась ламинэктомию в проекции Th6-Th7 для визуализации и доступа к спинному мозгу. Затем проводилось рассечение ткани спинного мозга в грудной части - pars thoracica - при помощи скальпеля и специального инструмента, разработанного для проведения экспериментальной работы. Разработанный для дозированного повреждения спинного мозга инструмент снабжен двумя ограничителями, позволяющими наносить травму 50% и 80-90% соответственно (рис. 1). По данным Ноздрачёва А.Д. - диаметр спинного мозга крысы в рассматриваемом сегменте составляет 5 мм [13]. В соответствии с этими данными, ограничитель A обеспечивает разрез глубиной 2,5 мм, что соответствует 50% диаметра спинного мозга, ограничитель B - 4 мм, что соответствует 80% указанного диаметра. В раннем послеоперационном периоде были соблюдены условия, способствовавшие наиболее эффективному восстановлению животных после операции. Животные содержались в оптимальных температурных условиях (27-28º), за счет введения физраствора восполнялась кровопотеря, обеспечивался доступ к еде и воде в необходимых количествах, в течение первых 3-4 суток после операции лабораторным животным проводилась антибиотикотерапия Ветбицином (2 мл), обработка послеоперационной раны спреем Террамицин. Также животным осуществлялся массаж и мануальная экскурсия мочевого пузыря в целях его опорожнения и профилактики застойных явлений и инфекционных осложнений. Степень восстановления функций при проведении исследования оценивалась по следующим показателям: 1) Шкала тяжести повреждения BBB (Basso, Beattie, and Bresnahan) для объективной визуальной оценки уровня неврологических расстройств и функционального исхода повреждения [14]. Оценка проводилась до операции, непосредственно после операции, а также на 14 сутки после операции. 2) Регистрация вызванных потенциалов области коры головного мозга с помощью специального оборудования (Рис. 2) и методики проводилась до операции, непосредственно после операции, а также на 14 сутки после операции; Оценка неврологического статуса при помощи шкалы BBB заключалась в визуальном анализе поведения животного и степени нарушения двигательных функций нижних конечностей в послеоперационном периоде сторонними наблюдателями, не имеющими информации о степени тяжести повреждения спинного мозга у крысы [14]. Шкала основана на оценке движений в диапазоне от 0 (отсутствие движений) до 21 баллов (передвижение без нарушений): оценка от 0 до 7 баллов концентрируется на движениях в тазобедренных, коленных и голеностопных суставах; от 8 до 13 - на постановке лап и координации движений; от 14 до 21 на стабильности корпуса и балансировке хвоста. Соматосенсорные вызванные потенциалы измерялись у всех животных до операции для получения исходных значений амплитуды и на 14 сутки после операции для подтверждения нарушения проводимости в позднем послеоперационном периоде. Регистрирующий игольчатый электрод устанавливался в череп животного в область проекции сенсомоторной коры, а стимулирующий - в область мышц сгибателей бедра. Стимуляция проводилась при помощи изолированного стимулятора постоянным током в соответствии со следующими параметрами: 3 мА, продолжительность стимула 20 мсек, частота 0,5 Гц. Обработка данных и статистический анализ производились при помощи программного обеспечения MATLAB и StatSoft STATISTICA 8.0. Для определения статистической значимости использовали тест Краскела-Уоллиса, и U-тест Манна-Уитни. Критический уровень статистической значимости в данном исследовании был принят равным 0,05. Результаты Показатели выживаемости животных в зависимости от объема повреждения соответствовали ожиданиям. Среди крыс с пересечением 50% спинного мозга выживаемость была достаточно высока и составляла 81,3% (13 из 16 животных). При пересечении 90%, 100% и при резекции спинного мозга выживаемость животных в первые сутки после хирургического вмешательства снижалась и составляла соответственно 63% (10 из 16), 69% (11 из 16) и 50% (8 из 16). Среди крыс в группе с разведением концов полностью пересеченного спинного мозга выжили 9 животных (56%). Таким образом, выживаемость животных напрямую коррелировала с тяжестью повреждения спинного мозга. Выживаемость животных к концу 2-й недели эксперимента также соответствовала степени повреждения. В I группе выжили все кроме одного животного. Во II, III, IV и V группах выжили соответственно 8, 8, 5 и 3 животных. Наиболее вероятной причиной смерти животных являлся острый воспалительный процесс, осложненный инфекцией мочевыводящих путей. Результаты комплексной оценки степени повреждения спинного мозга крыс на первые и 14-е сутки после операции представлены в таб. 1. На первые сутки после операции, умеренно выраженные движения в задних конечностях определялись только в I группе, где, по критериям шкалы BBB, у животных были отмечены умеренные движения в двух или более крупных суставах (чаще всего в тазобедренном и коленном). Во II группе у большинства животных были выявлены слабые или умеренно выраженные движения только в одном крупном суставе и у некоторых животных - слабые движения во втором суставе. У животных в остальных экспериментальных группах движений в нижних конечностях практически не обнаруживалось. Регистрируемые потенциалы на первые сутки после операции демонстрировали значительное снижение амплитуды, что соответствовало механическому нарушению целостности проводящих путей. Репрезентативные графики кривых вызванных потенциалов для первых трех групп изображены на рис. 3. Средняя по выборке исходная амплитуда вызванных потенциалов составляла 41,7±7,5 мкВ, при этом статистически значимых различий между группами выявлено не было. В I группе, снижение амплитуды составило в среднем 86,5±3,7%, во II группе - 95,6±4,7%, в остальных группах потенциал практически не регистрировался. На 14-е сутки после операции, движения разной степени выраженности в задних конечностях животных определялись только в первых трех группах. При этом, в группе I у всех животных отмечались выраженные движения в задних конечностях, и у большинства животных - движения во всех трех крупных суставах с периодическими попытками переставлять конечность, что соответствует 4-8 баллам по шкале BBB. В группе с 80% пересечением спинного мозга, у всех животных отмечались умеренные движения в двух или более крупных суставах. В группе со 100% пересечением спинного мозга у части животных были выявлены только слабые движения одного крупного сустава. В остальных двух группах у выживших животных движений в задних конечностях по-прежнему не отмечалось. При регистрации вызванных потенциалов, было выявлено, что их средняя амплитуда несколько увеличилась в I и II группах (на 7,7% и 2,8% соответственно) (p<0,05), а также появились слабые регистрируемые потенциалы у некоторых животных в группе со 100% пересечением. Обсуждение В ходе проведения экспериментальных работ на лабораторных крысах перед нами была поставлена задача разработать модель механического повреждения спинного мозга, которая могла бы быть использована при дальнейших исследованиях восстановления функций, утраченных в результате повреждения спинного мозга. На начальных этапах была отработана методика хирургического доступа к спинному мозгу животных посредством ляминэктомиии с последующим его пересечением при помощи специального инструмента, задающего определенный объем повреждения. Такой подход позволил обеспечить высокую степень воспроизводимости неполного пересечения спинного мозга в необходимом объеме в данной модели. Степень нарушения проведения нервных импульсов после пересечения спинного мозга оценивалась при помощи регистрации соматосенсорных вызванных потенциалов в области сенсомоторной коры головного мозга животных. Этот метод оценки позволил достоверно подтвердить нарушение непрерывности проводящих путей спинного мозга, а также отслеживать возможное восстановление как их непрерывности, так и проводимости в позднем послеоперационном периоде. Данные показали, что при резекции спинного мозга восстановления нейронных связей и проводимости не происходит. Однако при пересечении 50% наблюдалось некоторое спонтанное восстановление проводимости через 2 недели. Восстановление в такие же сроки у животных при пересечении 70-90% и 100%, практически не наблюдалось. Оценка восстановления проводимости спинного мозга в послеоперационном периоде проводилась и при помощи визуальной шкалы оценки двигательной активности. Как и следовало ожидать, наибольшая активность в отдаленном периоде наблюдалась у крыс с 50% пересечением, тогда как у крыс с резекцией и полным пересечением и разведением фрагментов спинного мозга восстановления активности в отдаленном периоде не наблюдалось. Показатели были однородно распределены по группам, что подтвердило состоятельность данной модели повреждения. На основании полученных данных можно предположить, что частичное восстановление нейронных связей происходит спонтанно, однако ее степень также коррелирует с объемом пересечения, а также с расстоянием между поврежденными фрагментами спинного мозга. Данная модель повреждения спинного мозга позволяет проводить исследования по регенерации клеток спинного мозга, так как обеспечивает достоверное и воспроизводимое нарушение проводимости клеток спинного мозга. Также модель дает возможность вводить в область повреждения необходимые экспериментальные агенты восстановления и достоверно оценивать динамику и степень восстановления проводимости поврежденных тканей. В целях повышения выживаемости экспериментальных животных необходимо строго соблюдать условия обеспечивающие наиболее быстрое и эффективное послеоперационное восстановление. Полученные в ходе работы данные будут применены для дальнейшей исследовательской работы по изучению возможности восстановления утраченных в результате повреждения проводящих путей функций организма в эксперименте. Выводы 1. При пересечении 50% спинного мозга, его проводимость практически полностью нарушается, однако через 14 дней происходит спонтанное восстановление проводимости до уровня 4,6±3,3 балла по шкале BBB и увеличение амплитуды регистрируемых вызванных потенциалов на 7,7%; 2. При пересечении 80-90% спинного мозга, его проводимость практически полностью нарушается, с незначительным спонтанным восстановлением проводимости через 14 дней до уровня 2,2±1,5 балла по шкале BBB BBB и увеличение амплитуды регистрируемых вызванных потенциалов на 2,8%; 3. При полном пересечении спинного мозга, его проводимость полностью нарушается. Через 14 дней у единичных животных отмечается спонтанное появление вызванных потенциалов низкой амплитуды и слабо выраженных движений; 4. При резекции спинного мозга на протяжении 1 см и его пересечении с разведением концов, его проводимость полностью нарушается, без последующего восстановления; 5. На процесс восстановления проводимости спинного мозга оказывает влияние расстояние между его проксимальным и дистальным фрагментами; 6. Динамика изменения уровня моторных функций соответствует динамике изменения амплитуды вызванных потенциалов после пересечения спинного мозга разной степени.

About the authors

S. P Mironov

Central Institute of Traumatology and Orthopaedics named after N.N. Priorov

S. V Kolesov

Central Institute of Traumatology and Orthopaedics named after N.N. Priorov

G. A Stepanov

Central Institute of Traumatology and Orthopaedics named after N.N. Priorov

M. L Sazhnev

Central Institute of Traumatology and Orthopaedics named after N.N. Priorov

Email: mak.sajnev@yandex.ru

S. P Gubin

Kurnakov Institute of General and Inorganic Chemistry, Moscow, Russia

Yu. V Ionin

Kurnakov Institute of General and Inorganic Chemistry, Moscow, Russia

V. G Motin

Central Institute of Traumatology and Orthopaedics named after N.N. Priorov

A. A Panteleev

Central Institute of Traumatology and Orthopaedics named after N.N. Priorov

References

Supplementary files