Changes in the composition of proteins in the blood during the period of ischemia-reperfusion syndrome, modeled by a violation of blood flow in the liver

Full Text

Введение. Проблема ишемии печени с последу- ющим развитием реперфузионного синдрома (РС) после восстановления кровотока актуальна во всем мире. Реперфузионный синдром печени сопрово- ждается дисфункцией микроциркуляторного русла и оксидативным стрессом, приводящим к некрозу и апоптозу гепатоцитов. Развитие РС печени носит мно- гоступенчатый и мультифакторный характер. Важную роль в его патогенезе играют токсические вещества, поступающие в системный кровоток, что обусловлива- ет общую интоксикацию. Восстановление кровотока не способствует устранению этих изменений, наобо- рот, ситуация усугубляется повреждающим действием свободных радикалов и цитокинов, поступающих в печень по мере реперфузии. Знание механизмов па- тофизиологических процессов, сопровождающих РС, может стать почвой для разработки новых, научно обо- снованных методик, позволяющих улучшить качество трансплантационных и других обширных операций на печени и снизить риск развития послеоперационных осложнений. Поэтому этой проблеме уделяется боль- шое внимание. Установлена важная роль в развитии РС процессов перекисного окисления липидов и системы антиоксидантной защиты [5]. В этот период в крови выявляется повышенная концентрация мар- керов поражения печени (аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы) и других ферментов, изменяется содержание белков [4]. Установлено, что повреждение мембран клеток и внутриклеточных органелл приводит к нарушению их проницаемости для воды и ионов, в результате чего развивается про- грессирующий отек и гибель клеток [7, 9]. Особый интерес представляют изменения состава белков крови. Эти изменения достоверно характе- ризуют состояние метаболической функции печени при РС. Цель исследования. На экспериментальной модели ишемии-реперфузии печени выявить ко- личественные изменения состава белков в крови животных. Материалы и методы. Эксперимент поставлен на 66 белых беспородных крысах обоих полов, раз- деленных на 3 группы. В 1-й группе (n=6) животные содержались в интактном состоянии, во 2-й и 3-й группах были животные с моделированной ишемией печени. Так, 2-я группа (n=30) - животные с ишемией продолжительностью 10 мин, 3-я группа (n=30) - жи- вотные с ишемией продолжительностью 20 минут. Жи- вотные 2-й и 3-й групп были разделены на 5 подгрупп по 6 животных в каждой. В каждой группе животным в 1-й подгруппе производили реперфузию в течение 60 мин, во 2-й подгруппе - 3 ч, в 3-й подгруппе - 24 ч, в 4-й подгруппе - 72 ч. Остальные 6 животных со- ставляли контрольную группу - это крысы, у которых 110 2 (62) - 2018 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Клинические исследования создавали модель ишемии соответствующей продол- жительности без последующей реперфузии. По истечении эксперимента животные декапити- ровались, кровь забиралась для лабораторных ис- следований. Вне опытов все животные по содержанию и питанию находились в одинаковых условиях. Все эксперименты на животных проводились согласно Европейской конвенции по защите позвоночных жи- вотных, используемых в экспериментальных и других научных целях [2]. Ишемию печени моделировали следующим об- разом. Всем экспериментальным животным внутри- мышечно вводили 1 мл раствора калипсола. После наступления наркоза по верхней средней линии вскрывалась брюшная полость, в которой хорошо про- сматривалось поле в области печеночных ворот. После введения в ложе печеночной артерии 2 мл раствора прокаина гидрохлорида вскрывали ложе артерии, от- ходящей к правой доле печени, и под него проводили лигатуру. Стягиванием лигатуры создавали модель ишемии, а расслаблением - модель реперфузии. Биохимические исследования проводили на ми- кроанализаторе «Bioskrem MS-2000» (Соединенные Штаты Америки). Определение содержания в крови общего белка, альбуминов, глобулинов, фибриногена проводили с использованием коммерческих наборов фирмы «Human», а фибриногена - по общепринятой методике [3]. Исходя из того, что калипсол вводился всем животным как в экспериментальных, так и в контрольных подгруппах, его влияние на изучаемые показатели не учитывались [6, 8]. Статистический анализ полученных результатов проводили непараметрическим методом Вилкоксона - Манна - Уитни [1]. Результаты и их обсуждение. Установлено, что фоновое содержание общего белка во 2-й группе по сравнению с 1-й группой понизилось на 0,9%, альбу- минов - на 1,5%. Содержание глобулинов практически не изменилось, а содержание фибриногена увеличи- лось на 33,3% (табл. 1). В период реперфузии продолжительностью 60 мин в 1-й подгруппе по сравнению с интактными значениями содержание общего белка снизилось на 9,7% (р>0,05), во 2-й подгруппе - на 18,5% (р<0,05), в 3-й - на 23,5% (р<0,05), в 4-й - на 26,9% (р<0,01). Содержание альбуминов в 1-й подгруппе снизи- лось на 15,8% (р<0,05), во 2-й подгруппе - на 23,9% (р<0,05), в 3-й - на 30,5% (р<0,05), в 4-й - на 35,3% (р<0,001). Содержание глобулинов в 1-й подгруппе повысилось на 14% (р>0,05), во 2-й подгруппе - на 27,3% (р<0,05), в 3-й - на 42% (р<0,01), в 4-й - на 46% (р<0,01). Содержание фибриногена в 1-й подгруппе повысилось на 150% (р<0,01), во 2-й подгруппе - на 177,8% (р<0,01), в 3-й - на 250% (р<0,01), в 4-й - на 69,4% (р<0,01). По сравнению с исходными значениями у животных 2-й группы содержание общего белка в 1-й подгруппе снизилось на 8,9% (р>0,05), во 2-й подгруппе - на 17,8% (р<0,05), в 3-й - на 22,8% (р<0,05), в 4-й - на 26,2% (р<0,01), рисунок 1. Содержание альбуминов в 1-й подгруппе снизи- лось на 14,6% (р>0,05), во 2-й подгруппе - на 22,8% (р<0,05), в 3-й подгруппе - на 29,5% (р<0,05), в 4-й подгруппе - на 34,3% (р<0,01). Содержание глобули- нов в 1-й подгруппе повысилось на 14% (р<0,05), во 2-й подгруппе - на 27,3% (р<0,05), в 3-й подгруппе - на 42% (р<0,01), в 4-й подгруппе - на 46% (р<0,01). Содержание фибриногена в 1-й подгруппе повыси- Содержание исследуемых белков в плазме крови крыс на фоне ишемии с последующей реперфузией, г/л (М±m) Таблица 1 Показатель Общ. белок Альбумины Глобулины Фибриноген 1-я группа Фон 73,8±2,5 45,3±1,7 25±1,6 3±0,37 2-я группа Фон 73,2±2,7 44,7±1,8 25±1,5 4±0,58 1-я подгруппа 66,7±3,3 38,2±2,6* 28,5±1,2 7,5±0,76**^ 2-я подгруппа 60,2±2,8*^ 34,5±2,5*^ 31,8±1,2*^ 8,33±0,88**^^ 3-я подгруппа 56,5±2,9*^ 31,5±2,6*^ 35,5±1,5**^^ 10,5±1,34**^^ 4-я подгруппа 54±2,4**^^ 29,3±2,2**^^ 36,5±1,5**^^ 11,3±1,33**^^ 3-я группа Фон 72,5±2,6 44±1,9 25,7±1,4 4,5±0,76 1-я подгруппа 68,7±2,7 40,5±2,5 29,2±1 7,83±0,95**^ 2-я подгруппа 65±2,6 37,2±2*^ 32,5±0,8**^^ 11,2±0,79**^^ 3-я подгруппа 62±2,6*^ 35,2±2*^ 35,8±1,1**^^ 13,7±0,88**^^ 4-я подгруппа 59,2±2,2**^^ 32,2±1,8**^^ 38,2±1,1**^^ 16±1,06**^^ Примечание: различия с показателями 1-й группы: * - р<0,05; ** - р<0,01; с фоновыми показателями своей группы: ^ - р<0,05; ^^ - р<0,01. ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ 2 (62) - 2018 111 Клинические исследования Рис. 1. Снижение содержания белков на фоне реперфузии после 10-минутной ишемии с указанием планки погрешностей со стандартными ошибками по сравнению с фоновыми значениями лось на 87,5% (р<0,01), во 2-й подгруппе - на 108,3% (р<0,01), в 3-й подгруппе - на 162,5% (р<0,01), в 4-й подгруппе - на 183,3% (р<0,01). Таким образом, по- ниженное на фоне 10-минутной ишемии содержание общего белка и альбуминов в период реперфузии не восстанавливается, а наоборот, продолжает пони- жаться, причем с увеличением времени реперфузии их показатели динамично снижаются. Одновременно содержание глобулинов и фибриногена увеличивается во времени. У животных 3-й группы (см. табл. 1), по сравнению с животными 1-й группы, содержание общего белка снизилось на 1,8% (р<0,05), а альбуминов - на 2,9% (р<0,05). При этом содержание глобулинов увели- чилось на 2,7% (р<0,05), а фибриногена - на 50% (р<0,05). На фоне реперфузии в этой группе содер- жание общего белка в 1-й подгруппе снизилось на 7% (р<0,05), во 2-й подгруппе - на 12% (р>0,05), в 3-й подгруппе - на 16% (р<0,05), в 4-й подгруппе - на 19,9% (р<0,01). Рис. 2. Снижение содержания белков на фоне реперфузии после ишемии в течение 20 минут по сравнению с фоновыми значениями с указанием планки погрешностей со стандартными ошибками 112 2 (62) - 2018 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Клинические исследования По сравнению с интактными значениями содержа- ние альбуминов в 1-й подгруппе снизилось на 10,7% (р<0,05), во 2-й подгруппе - на 18% (р<0,05), в 3-й подгруппе - на 22,4% (р<0,05), в 4-й подгруппе - на 29% (р<0,01). Содержание глобулинов в 1-й подгруппе повысилось на 16,7% (р<0,05), во 2-й подгруппе - на 30% (р<0,01), в 3-й подгруппе - на 43,3% (р<0,01), в 4-й подгруппе - на 52,7% (р<0,01). Содержание фибриногена в 1-й подгруппе повысилось на 161,1% (р<0,01), во 2-й подгруппе - на 272,2% (р<0,01), в 3-й подгруппе - на 355,6% (р<0,01), в 4-й подгруппе - на 433,3% (р<0,01). По сравнению с исходными значениями содержа- ние общего белка в 1-й подгруппе снизилось на 5,3% (р>0,05), во 2-й подгруппе - на 10,3% (р<0,05), в 3-й подгруппе - на 14,5% (р<0,05), в 4-й подгруппе - на 18,4% (р<0,01), рисунок 2. Содержание альбуминов в 1-й подгруппе снизи- лось на 8% (р>0,05), во 2-й подгруппе - на 15,5% (р<0,05), в 3-й подгруппе - на 20,1% (р<0,05), в 4-й подгруппе - на 26,9% (р<0,01). Содержание глобулинов в 1-й подгруппе повысилось на 13,6% (р>0,05), во 2-й подгруппе - на 26,6% (р<0,01), в 3-й подгруппе - на 39,6% (р<0,01), в 4-й подгруп- пе - на 48,7% (р<0,01). Содержание фибриногена в 1-й подгруппе повысилось на 161,1% (р<0,01), во 2-й подгруппе - на 148,1% (р<0,01), в 3-й под- группе - на 203,7% (р<0,01), в 4-й подгруппе - на 255,6% (р<0,01). Следовательно, пониженное на фоне 20-минутной ишемии содержание общего белка и альбуминов в период реперфузии не вос- станавливается, а наоборот, продолжает понижать- ся, причём с увеличением времени реперфузии их показатели динамично снижаются. Одновременно содержание глобулинов и фибриногена увеличива- ется во времени. Анализ полученных данных показал, что незначи- тельное в процентном отношении, но очень важное для жизнедеятельности организма снижение со- держания общего белка происходит в период 10- и 20-минутной ишемии на 0,9 и 1,8% соответственно. В период реперфузии функциональные возможности гепатоцитов не восстанавливаются, а наоборот, их деструкция усугубляется наличием в крови токсиче- ских веществ, которые накопились в крови за период отключения печени от общей системы жизнеобеспе- чения организма. Поэтому понижение содержания общего белка идет усиленными темпами: к 72 ч ре- перфузии дефицит белков в крови уже составлял во 2-й группе 26,9%, а в 3-й группе - 19,9%. Однако, как видно из полученных данных, в 3-й группе, где на- ходились животные с моделированной 20-минутной ишемией печени на фоне реперфузии продолжи- тельностью 72 ч, дефицит белков был на 7% ниже по сравнению со 2-й группой, где находились животные с моделированной 10-минутной ишемией печени на фоне 72-часовой реперфузии. Как и следовало ожидать, на фоне общей ин- токсикации и воспалительного процесса, сопровождающих ишемию печени [10, 11], понижается содержание альбуминовой фракции и повышается содержание глобулиновой фракции. Сни жение уровня альбуминов в крови наблюдается уже в период 10-минутной ишемии, но в этот период не наблюдается изменения в содержании глобулинов. Это означает, что защитные механизмы, где фракция глобулинов играет ключевую роль, еще не активи- ровались. Увеличение времени ишемии до 20 мин приводит к значительному снижению уровня аль- буминов, но уровень глобулинов при этом начинает повышаться. Значит, организм включает защитные механизмы. Процесс однонаправленно продолжа- ется и в период реперфузии: в обеих группах во всех подгруппах уровень альбуминов понижается, а уровень глобулинов повышается, причем это повы- шение более значительно в подгруппах 3-й группы, где находились животные, у которых моделировали 20-минутную ишемию. Уровень фибриногена увеличивается во все перио- ды ишемии и реперфузии, причем в 3-й группе более интенсивно, чем во 2-й группе. Заключение. Показано, что на фоне ишемии в плазме крови экспериментальных животных проис- ходит изменение количественного содержания обще- го белка, альбуминов, глобулинов и фибриногена. С увеличением продолжительности ишемии патологи- ческие изменения увеличиваются. При реперфузии процесс продолжается однонаправленно, но при этом на фоне более глубокой 20-минутной ишемии некоторые показатели патологического изменения состава крови менее выражены, чем на фоне репер- фузии после 10-минутной ишемии. Этот феномен объясняется активацией защитных и адаптационных функций организма.

About the authors

G Sh Garayev

J R Gafarova

R E Jafarova

Email: rjafarova@bk.ru

References

Supplementary files