Evaluation of the opportunity of conservation of plasma and blood serum by freezing for the following investigation of vitamins content

Full Text

Введение. Проблема недостаточной обеспечен- ности организма витаминами, по данным большин- ства отечественных и зарубежных авторов, занимаю- щихся вопросами витаминологии, не утратила своей актуальности в последние годы, несмотря на расши- рение возможностей пищевой и фармацевтической промышленности и повышение уровня санитарной грамотности населения [5]. Особую значимость вита- минная обеспеченность имеет для лиц экстремальных профессий, к которым можно отнести и военнослужа- щих, а также для лиц, работающих и проживающих в регионах с неблагоприятными климатическими усло- виями, к которым, в частности, относятся территории Арктической зоны Российской Федерации [3, 4]. В последние десятилетия благодаря достижениям науки и техники, введению в практику и повышению доступности современных методик лабораторной диагностики расширились диагностические воз- можности для определения содержания витаминов в крови человека, являющихся основанием для при- менения лечебных и профилактических мероприятий, контроля эффективности витаминотерапии. К таким современным и уже вполне доступным на практике методикам следует отнести прежде всего высоко- эффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) и иммуноферментный анализ [2]. Вместе с тем указанные диагностические воз- можности доступны в основном в крупных городах в медицинских организациях с расширенными лабо- раторными возможностями. При этом потребность в анализе содержания витаминов в крови пациентов имеется как в удаленных местностях, так и в тех случаях, когда либо невозможно приблизить лабо- раторную базу к месту отбора образцов, либо не- медленная отправка образцов крови в лабораторию по каким-либо причинами невозможна (например, скрининговые обследования с отбором большого количества образцов и т. п.) [1]. Всё сказанное в полной мере относится к войско- вому звену медицинской службы, которое обладает ограниченными лабораторными возможностями, как правило, достаточно удалено территориально от крупных лабораторных центров, имеет сложную ло- гистику лабораторных проб, но при этом лечебную и 138 4 (64) - 2018 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Экспериментальные исследования профилактическую медицинскую помощь для крупных контингентов военнослужащих [3]. В аннотациях большинства методик исследования крови человека на содержание витаминов обычно указываются весьма короткие сроки от забора про- бы до начала анализа, что объясняется нестойкостью витаминов и их быстрым разрушением (особенно актуально для быстро окисляемых витаминов - А, D и Е). То есть анализ содержания витамина в образце плазмы или сыворотки, хранимой при комнатной тем- пературе, рекомендовано проводить в ближайшие 4 ч, а по некоторым данным - 2 ч с момента отбора [7]. Эти временные ограничения анализа делают его практически невозможным без перемещения обследуемого лица в непосредственную близость к лаборатории, что само по себе ограничивает приме- нение данного вида исследований, а для массовых обследований вовсе делает его невозможным. Столкнувшись с задачей проведения исследова- ний содержания витаминов в крови у лиц, проходящих военную службу в удаленных местностях Арктической зоны Российской Федерации, авторы встали перед проблемой выбора способа консервации и длитель- ной транспортировки образцов крови обследуемых, для последующего анализа в лабораторных условиях. Изучение опыта отечественных и зарубежных коллег дало неоднозначные результаты. Непосред- ственные исследования и эксперименты по данной проблеме в литературе последних лет детально не описаны. Некоторые методики консервации непри- годны для длительной транспортировки. Мнение о влиянии заморозки и последующей разморозки на концентрацию витаминов в образце неоднозначно и носит скорее характер предположений. Наиболее простым, универсальным и доступным способом консервации образцов плазмы и сыворотки крови является заморозка. Из общих знаний о биохимии витаминов не следует вывод от том, что заморозка самого витамина долж- на непременно вести к его разрушению. Напротив, охлаждение и заморозка используются для хранения многих витаминных субстанций. Сами образцы плаз- мы и сыворотки в клинической и лабораторной прак- тике регулярно подвергаются заморозке для самых различных задач. В то же время компоненты крови (плазма, сыворотка) обладают рядом специфических свойств, взаимодействие которых с витаминами в процессе заморозки-разморозки не описано. Для решения вопроса исследователями поставлен эксперимент с заморозкой образцов плазмы и сыво- ротки человека на различный срок, с последующим анализом содержания в них витаминов и сравнением результатов. Цель исследования. Установить влияние замо- розки и сроков хранения образцов плазмы и сыворот- ки человека на концентрацию в них витаминов. Материалы и методы. Материал - сыворотка крови и плазма крови, полученные у 40 18-25-летних мужчин, не получавших витаминные препараты в течение 14 дней до забора крови. Кровь пациентов забиралась из локтевой вены утром натощак в сухие вакуумные пробирки для сыворотки и плазмы крови с этилендиаминтетрауксусной кислотой. После цен- трифугирования со скоростью 3000 об/мин плазма и сыворотка отбиралась в пластиковые микропро- бирки емкостью 0,5-2 мл, которые сразу переме- щались в морозильную камеру и замораживались при температуре минус 18°С. В целях практической пригодности методики был выбран способ замороз- ки образцов до температуры минус 18°С в обычной морозильной камере медицинского морозильника и последующего хранения при той же температуре. Время от момента забора крови до заморозки не превышало 120 мин. От каждого обследуемого исследовались четыре серии плазмы и сыворотки: свежая плазма/сыворотка (без заморозки), плазма/сыворотка после заморозки и хранения при температуре минус 18°С длительно- стью 7, 60 и 120 сут. Замороженные образцы размо- раживались пассивно при комнатной температуре непосредственно перед анализом. В образцах исследовалось содержание перечня витаминов, определенного в соответствии с постав- ленными для последующих этапов исследования задачами: В9, В1 (оценивался косвенно по уровню пировиноградной кислоты (ПВК), В2, В12, С, А, D и Е. Для лабораторного исследования образцов использовались следующие методики и оборудование: - иммунохемолюминисценция, анализатор «Beckmann-CoulterDxI 800» (Соединенные Штаты Америки - США); - ВЭЖХ, аппарат «ВЭЖХ Аgilent-1200» (США); - классическое титрование по Тильмансу с исполь- зованием колонки для титрования; - флюориметрия, флюориметр «Флюорат-02- АБЛФ-Т» (Российская Федерация); - спектрофотометрия, спектрофотометр «СФ- 2000» (Российская Федераци). Результаты исследования сравнивались с исполь- зованием параметрического t-критерия Стьюдента для зависимых выборок для оценки значимости раз- личий средних значений, а также с использованием метода попарных сравнений. Исходные показатели в свежем образце плазмы/сыворотки сравнивались с тем же показателями того же образца после за- морозки на 7, 60 и 120 сут соответственно, уровень статистической значимости различий установлен для p<0,05 [6]. Результаты и их обсуждение. Установлено, что максимальные колебания концентраций витаминов в отдельных образцах, взятых у одного и того же обсле- дуемого до и после заморозки на 7, 60 и 120 сут, не превышали не превышали 10% от исходного значения. В среднем по выборке эти колебания еще меньше и находятся в пределах 0,5 - 3% от исходного значения показателя (таблица). ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ 4 (64) - 2018 139 Экспериментальные исследования Cредние значения концентраций витаминов в исходном и замороженных образцах Таблица Витамин Среда В день забора После заморозки при температуре минус 18°С Витамин Среда В день забора 7 сут 60 сут 120 сут В9, нг/мл Сыворотка 4,65±0,33 4,64±0,32 4,67±0,33 4,67±0,33 В12, нг/мл Сыворотка 236,8±15,6 235,5±15,6 236,0±15,5 235,3±15,7 А, мг/л Плазма 0,256±0,014 0,255±0,014 0,256±0,014 0,255±0,014 Е, мг/л Плазма 2,698±0,136 2,683±0,136 2,677±0,137 2,707±0,139 D3, нг/мл Плазма 7,403±0,721 7,382±0,725 7,339±0,724 7,322±0,723 D2, нг/мл Плазма 76,85±6,38 76,84±6,37 76,66±6,37 76,61±6,39 В1, косвенно по ПВК, мкг/мл Плазма 6,188±0,275 6,222±0,276 6,183±0,279 6,185±0,271 В2, мкг/л Плазма 3,405±0,256 3,396±0,257 3,402±0,259 3,417±0,256 С, мг/ Плазма 7,330±0,143 7,300±0,141 7,288±0,148 7,318±0,142 Для выявления степени значимости различий среднего значения выборки по продолжительности заморозки сравнивались попарно с исходным значе- нием. При сравнении результатов средних значений исследуемых показателей с использованием пара- метрического t-критерия Стьюдента для зависимых выборок значимых различий концентраций витаминов в исходном и замороженном образце не выявлено (p>0,05). Различий исследуемых показателей в ди- намике также не выявлено. Все это свидетельствует об отсутствии значимого влияния заморозки образца плазмы/сыворотки крови на содержание в нем определяемых витаминов. Сле- довательно, образцы плазмы/сыворотки крови могут быть законсервированы путем обычной заморозки при температуре минус 18 °С для дальнейшей пере- возки и хранения в замороженном состоянии в целях последующего определения содержания витаминов В1, В2, В9, В12, С, А, D и Е. При этом значения измерений после заморозки не будут достоверно отличаться от значений, которые могли быть получены при иссле- довании исходного (свежего) образца. Заключение. Возможность заморозки сыворотки и плазмы крови для последующего определения со- держания в них витаминов имеет большое практиче- ское значение. Это дает возможность исследования витаминов в крови обследуемых лиц во временной период, отдаленный от момента забора крови, при условии надлежащей транспортировки и хранения образцов плазмы или сыворотки в замороженном со- стоянии при температуре минус 18 °С. Помимо транс- портировки образцов из удаленных районов, такой подход позволяет организовать их хранение сроком не более 120 сут для последующего исследования, что дает возможность планировать равномерное распределение загрузки лабораторных мощностей при массовых обследованиях. Для транспортировки образцов в замороженном состоянии рекомендуется использовать специальные термоконтейнеры либо портативные морозильные камеры с заранее намороженными хладоэлементами и встроенным термодатчиком для обеспечения кон- троля надлежащей температуры в контейнере. Существенно, что вывод о возможности заморозки сред без существенной потери концентрации сдела- но на основе одновременного исследования девяти витаминных субстанций, а не путем экстраполяции результатов анализа одного-двух компонентов, что зачастую встречается в исследованиях. Опыт использования представленной в настоящем исследовании методики заморозки и хранения об- разцов плазмы и сыворотки крови для последующего исследования в них содержания витаминов с целью определения витаминной обеспеченности военнослу- жащих, проходящих службу в Арктической зоны Рос- сийской Федерации может применяться для отбора проб в удаленных местностях в условиях обычного медицинского пункта.

About the authors

N N Kirichenko

Email: vmeda-nio@mil.ru

V V Zakrevskiy

A L Smetanin

Email: vmeda-nio@mil.ru

I A Konovalova

Ye S Martynova

Email: vmeda-nio@mil.ru

L P Lazarenko

Email: vmeda-nio@mil.ru

References

Supplementary files