Вiological effects of viroids

Full Text

По мере того как методы этиологической диагно- стики инфекционной патологии, в первую очередь иммунологические и молекулярно-генетические, достигли практически 100%-ной чувствительности и специфичности, мы все больше узнаем о микробных агентах, о которых до недавнего времени и не подо- зревали. Несмотря на то, что на настоящий момент не доказано, что вироиды могут быть причиной инфек- ционной патологии у людей, однако многочисленные данные свидетельствуют о том, что они могут быть причиной развития реакций гиперчувствительности, в итоге приводящих к развитию инфекционной пато- логии, связанной с аутомикрофлорой [2, 4]. Одними из таких многочисленных микробных агентов являются вироиды. Вироиды - высокоин- фекционные микробные агенты, состоящие только из кольцевой высококомплементарной одноцепочеч- ной рибонуклеиновой кислоты (оцРНК), не покрытой белковой оболочкой, характерной для вирусов РНК. Они вызывают различные болезни растений, овощей, фруктов и др. Считается, что более трети вирусных заболеваний растений вызываются вироидами [7]. Однако не установлено, что они могут быть причиной инфекционной заболеваемости у человека, но человек практически ежедневно контактирует с растениями, фруктами, овощами, контаминированными вирои- дами. Поэтому чрезвычайно интересным является изучение их биологических эффектов с точки зрения их возможного влияния на иммунный гомеостаз чело- века. Все это пока полностью не исследовано. Вироиды способны переходить из клетки в клетку только в том случае, если клетка-донор и клетка- реципиент оказываются поврежденными. Вироиды могут распространяться как горизонтально (переда- ются с посадочным материалом, во время прививок, механической инокуляцией), так и вертикально (с семенами и пыльцой). Биологические переносчики, осуществляющие горизонтальную передачу, не уста- новлены. Болезни растений, вызываемые вироидами, получили название вироидозы. Вироидозы по своим проявлениям существенно не отличаются от других вирусных болезней растений. Первым вироидозом, привлекшим внимание вирусологов, была болезнь веретеновидности клубней картофеля, вызываемая вироидом веретеновидности клубней картофеля (ВВКК) [10, 12]. Этот вироид обладает поразительной устойчивостью к действию ингибиторов, которые со- держатся в созревающих семенах и обычно инактиви- руют вирусы картофеля. Это оригинальное свойство ВВКК определяет его способность передаваться с семенами и пыльцой. Другой повсеместно рас- пространенный вироидоз - экзокортис цитрусовых. Вироид экзокортиса цитрусовых поражает лимонные, апельсиновые и мандариновые деревья. Заболевание характеризуется задержкой роста, усилением ветвле- ния побегов, отслаиванием коры, хлорозом листьев. Этот вироид передается только горизонтально [8]. Что лежит в основе патогенетических свойств вироидов, пока не ясно. Предполагается, что эти свойства не являются первичным свойством ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ 2 (62) - 2018 209 Обзоры генетических элементов, от которых произошли вироиды. Самые малые вироиды - малые цитоплазматиче- ские РНК вируса жёлтой крапчатости риса - имеют длину всего 220 нуклеотидов. Для сравнения: геном самого маленького известного вируса, способного вызывать инфекцию, имеет размер около 2000 ос- нований. В живых организмах встречаются и другие молекулярные патогены, не относящиеся к вироидам. Существование структур, подобных вироидам, но построенных из дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), предполагается и у животных. Они называются субвирусными частицами. Известно, что некоторые фрагменты белков способны контролировать свое воспроизведение в клетках животных без участия нуклеиновых кислот [6]. Такие частицы называют «прионами». Вироиды имеют ковалентно замкнутые кольцевые оцРНК длиной от 246 до 467 нуклеотидов. Обычно кольцевая РНК вироидов существует в виде палоч- ковидной формы из-за спаривания азотистых ос- нований внутри цепи, в результате чего образуются двухцепочечные участки с одноцепочечными петлями. Некоторые вироиды находятся в ядрышке инфици- рованной клетки, где может присутствовать от 200 до 100000 копий генома вироида. Другие вироиды располагаются в хлоропластах [9, 13]. РНК вироидов не кодирует каких-либо белков, поэтому вироиды не могут реплицироваться сами по себе. Предполагается, что для этих целей они ис- пользуют ДНК-зависимую РНК-полимеразу клетки- хозяина - фермент, который обычно используется для синтеза РНК на матрице ДНК. Однако в инфици- рованной вироидом клетке этот фермент в качестве матрицы для синтеза РНК использует РНК вироида, а не ДНК клетки-хозяина. Эта молекула РНК, компле- ментарная геному вироида, используется как матрица для синтеза новых РНК вироида [11]. Растение, заражённое вироидом, может не про- являть никаких симптомов. Однако тот же самый вироид может вызывать серьёзную болезнь у дру- гого вида растений. Основы патогенности вироидов ещё не определены, однако известно, что для неё необходимы некоторые участки вироидной РНК. Не- которые данные свидетельствуют о том, что вироиды вызывают болезнь, активируя механизмы в эукарио- тической клетке, которые в норме работают для за- щиты клетки от вирусов, чей геном представлен дву- цепочечной РНК (дцРНК). Это способствует тому, что клетка распознаёт дцРНК и селективно разрушает их. Вироиды могут вмешиваться в этот процесс, компле- ментарно связываясь (гибридизуясь) со специфиче- скими молекулами РНК клетки-хозяина. Образование гибридных дцРНК из РНК вироида и клетки запускает механизм, направленный на разрушение гибридного комплекса. В результате разрушается матричная РНК (мРНК) клетки-хозяина и происходит процесс пода- вления экспрессии её определённых генов. Невоз- можность экспрессировать важный ген обусловливает болезнь у растения-хозяина. Впрочем, имеются предположения и о других механизмах действия вироидов на растительные клетки [6, 12]. Вироиды относятся к числу способных к реплика- ции РНК-содержащих патогенов, которые вызывают различные заболевания у растений и животных. Поми- мо вироидов, к таким патогенам относят сателлитные РНК, вироид-подобные растительные сателлитные РНК, а также вирус гепатита дельта человека. Впервые о вироидах, вернее о болезнях, вызы- ваемых ими, стало известно в 1920-х годах. Ферме- ры Нью-Йорка и Нью-Джерси заметили у картофе- ля симптомы неизвестного заболевания. Клубни по- ражённых растений утрачивали привычную форму и становились веретеновидными, из-за чего эта болезнь была названа веретеновидностью клубней картофеля. Симптомы заболевания появлялись у рас- тений, контактировавших с фрагментами заражённых экземпляров, следовательно, болезнь вызывалась агентом, который мог передаваться от одного расте- ния к другому. Однако у поражённых растений не обна- руживалось необычного грибка или бактерии, поэтому был сделан вывод, что болезнь вызывается вирусом. Несмотря на многочисленные попытки изолировать и очистить этот вирус из экстракта веретеновидного картофеля с использованием всё более усложняю- щихся методик, выделить его так и не удалось [8]. В 1971 г. Теодор О. Динер [12] показал, что этот инфекционный агент был не вирусом, а патогеном совершенно нового типа, размер которого составлял одну восьмидесятую от размера типичного вируса, и предложил для него термин «вироид», то есть «виру- соподобный». Параллельно велись и сельскохозяй- ственные исследования особенностей вироидов, и фундаментальные научные исследования, направ- ленные на изучение их физических, химических и макромолекулярных свойств. В 1976 г. стало известно, что патоген, вызывающий веретеновидность клубней картофеля, представляет собой «одноцепочечную, ковалентно замкнутую, кольцевую молекулу РНК, из- за спаривания оснований приобретающую плотную палочковидную структуру». Это было первое описание природы вироидов, и они стали первыми патогенами эукариот, для которых была определена полная моле- кулярная структура [9, 12]. Все вироиды обладают выраженным структурным сходством. Все изученные к настоящему времени вироиды имеют гомологию нуклеотидных последо- вательностей, равную 70-80%. При этом обнаружи- ваются последовательности, типичные для концов транспозонов, оканчивающихся на урацил - гуанин и цитозин - аденин. РНК вироидов в отличие от вирусов, которые дер- жат свой генетический материал в белковой оболочке (капсиде), представляет собой голенькие петельки РНК. Все колечко состоит меньше чем из 400 нуклео- тидов - вирус гриппа с его 14 тысячами нуклеотидов на этом фоне предстает исполином, а у человека их 3,2 млрд пар. Тем не менее для репродукции и пары сотен вполне достаточно, главное - проникнуть в растение через ранку от секатора и использовать его ферменты. 210 2 (62) - 2018 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Обзоры Важно понять, что РНК вироидов не кодирует соб- ственные ферменты для репликации и вообще какие- либо белки, что может свидетельствовать об их проис- хождении в добелковые времена, «первую эпоху мира РНК», когда еще не существовало рибосом. Вместе с тем она сама обладает каталитической рибозимной активностью - то есть может отщепить саму себя в нужном месте. Основные свойства вироидов можно представить так: 1. Вироиды очень малы, что облегчает репликацию; 2. РНК вироидов имеет большое содержание гуа- нина и цитозина, что увеличивает их стабильность и точность репликации; 3. Кольцевая структура обеспечивает репликацию на высоком уровне. 4. Существование периодичности в структуре, что допускает их сборку в качестве модульных единиц в более крупные геномы; 5. Вироиды не кодируют белки, что делает возмож- ным их существование в среде без рибосом; 6. У некоторых вироидов в репликации участвуют рибозимы - характерные элементы РНК-мира. На основании сравнительного анализа последова- тельностей и наличия центрального консервативно- го участка в молекуле геномной РНК все известные на данный момент вироиды разделяют на два семейства: 1. Группа А (Avsunviroidae): 1.1. Avsunviroid 1.1.1. ASBVd (вироид пятнистости авокадо) 1.2. Pelamoviroid (вироид латентной мозаичности персика) 1.2.1. PLMVd (вироид латентной мозаичности персика) 1.2.2. CChMVd (вироид хлоротичных пятен хри- зантемы) 1.3. Elaviroid (латентный вироид баклажана) 1.3.1. ELVd (латентный вироид баклажана) 2. Группа В (Pospiviroidae) 2.1. Pospiviroid (вироид, придающий клубням кар- тофеля веретенообразную форму). 2.1.1. PSTVd (вироид веретеновидности карто- феля) 2.2. Cocadviroid 2.2.1. CCCVd (вироид каданг-каданга кокосовой пальмы) 2.3. Hostuviroid 2.3.1. HSVd (вироид карликовости хмеля) 2.4. Apscaviroid 2.4.1. ASSVd (вироид рубцов на кожице яблок). 2.5. Coleviroid 2.5.1. CbVd-1 (вироид колеуса Блюма-1) Анализ последовательностей показывает, что РНК членов семейства Pospiviroidae имеет 5 доменов: TL (терминальный левый), P (патогенный), C (цен- тральный), V (вариабельный) и TR (терминальный пра- вый). Границы между этими доменами определяются по резкому изменению в степени гомологии последо- вательностей у различных вироидов. Раньше счита- лось, что эти домены имеют специфичные функции, например, домен Р связан с патогенностью вироида. Однако впоследствии оказалось, что причины, лежа- щие в основе патогенности вироидов, более сложны, и проявление симптомов заболевания в настоящее время связывают с различными детерминантами, располагающимися в разных доменах. Члены этого семейства подразделяются на пять родов главным образом на основании наличия высококонсерватив- ных последовательностей в домене C и отчасти на основании наличия гомологий в последовательностях других доменов (рис.) [6, 9]. Таксономический статус группы вироидов не определён. В настоящее время семейства вироидов рассматриваются в числе семейств вирусов, не от- носящихся к определённому порядку. В 2016 году Di Serio [9] было предложено включить вироиды в состав Рис. Структура вироидов двух семейств с указанием доменов ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ 2 (62) - 2018 211 Обзоры предложенного царства Acytota, содержащего бес- клеточные живые организмы. Вироидная РНК проявляет высокую степень спаривания оснований по всей молекуле. РНК чле- нов Pospiviroidae сворачивается в палочковидную структуру, в которой короткие двуцепочечные участки разделяются небольшими одноцепочечными петлями. Хотя предполагается, что вироид пятнистости авокадо также имеет палочковидную вторичную структуру. Два других члена семейства Avsunviroidae - вироид ла- тентной мозаичности персика и вироид хлоротичных пятен хризантемы - имеют более сложные вторичные структуры, в которых от центральной (коровой) части отходят несколько шпилек. Структура вироидов вну- три клетки остаётся невыясненной, и возможно, что вироидные РНК принимают несколько альтернатив- ных конформаций на различных этапах жизненного цикла [8]. Принято считать, что наиболее распространённая и часто встречаемая форма вироидной РНК условно имеет положительную полярность, а комплементар- ная ей цепь - отрицательную. Стандартное определе- ние полярности для РНК, при котором положительную полярность имеет цепь, кодирующая белок, в случае вироидов неприменимо, и принятые значения поляр- ности выбраны произвольно [10]. Репликация вироидов осуществляется по меха- низму катящегося кольца, при котором на кольце- вой РНК, используемой в качестве матрицы, синте- зируются линейные мультимеры. РНК-полимераза клетки-хозяина синтезирует на кольцевой РНК, имеющей положительную полярность, одноцепо- чечную линейную комплементарную минус-цепь. Поскольку на РНК-матрице нет выраженных сиг- налов терминации для РНК-полимеразы, транс- крипция может идти по кругу в несколько циклов, в результате чего образуется линейная мультимер- ная РНК [12]. У Av sunviroidae эти мультимерные РНК далее разрезаются на отдельные мономерные минус-це- пи, которые замыкаются в кольцо. Такие кольцевые минус-РНК в дальнейшем служат для аналогичного процесса - синтеза мультимерных линейных плюс- цепей РНК, которые разрезаются на мономеры, за- мыкающиеся в кольцо. Такой цикл может давать не- сколько новых дочерних плюс-цепей РНК с исходной плюс-матрицы, поскольку и в первом, и во втором случае матрица транскрибируется больше, чем один раз. Такая репликация называется симметричной, потому что и плюс-, и минус-цепи реплицируются одинаково. Описанный выше цикл репликации по типу катяще- гося кольца требует работы трёх ферментов: 1. РНК-зависимой РНК-полимеразы, которая син- тезирует мультимерные линейные цепи; 2. РНК-разрезающего фермента (эндорибону- клеазы), которая разрезает мультимерные цепи на линейные мономеры; 3. РНК-лигазы, которая замыкает линейные моно- меры в кольцо. Лигирование у вироидов членов семейства Avsunviroidae может происходить без участия белков клетки-хозяина. По этой причине предполагается, что для репликации вироидам семейства Avsunviroidae необходима лишь РНК-полимераза клетки-хозяина, так как они способны к саморазрезанию и самолиги- рованию без помощи белков [12]. Напротив, вироидам Pospiviroidae необходимы ферменты клетки-хозяина для осуществления всех этапов жизненного цикла: полимеризации, раз- резания и лигирования. Показано, что РНК-лигаза проростков пшеницы, участвующая в сплайсинге интронов тРНК, может замыкать в кольцо линейные мономеры вироида веретеновидности клубней карто- феля. Этот фермент, который образует 3’→5’-фосфоди- эфирные связи, локализован в ядре, из-за чего пред- ставляется логичным кандидатом на роль фермента, осуществляющего лигирование РНК Pospiviroidae [12]. Наиболее вероятным способом передачи вироидов, как было показано выше, является передача через механические повреждения. Такой механизм передачи широко распространён среди патогенов растений. Инфекционный агент попадает в незара- жённое растение при непосредственном контакте с заражённым, при использовании заражённых садовых инструментов, через семена, пыльцу или через насе- комых-переносчиков (тлей или шмелей, однако такой способ передачи представляется сомнительным). В этом случае вироид может заключаться в вирусный капсид, так что образуется вирусная частица, содер- жащая внутри вироид. Это значительно облегчает распространение вироида и усложняет контроль его распространения [10]. Попав в новое растение, вироиды приступают к репликации и размножению, перемещаясь в другие клетки посредством межклеточных мостиков (плаз- модесм). При вироидных инфекциях наблюдаются разнообразные симптомы, которые могут затра- гивать как всё растение в целом, так и отдельные органы: листья, плоды, цветки, корни. К числу таких симптомов можно отнести обесцвечивание листьев, карликовость, появление оранжевых пятен, усиленное образование плодов, из которых лишь немногие со- зревают, и др. На степень выраженности симптомов влияют последовательность и строение геномной РНК вироидов, состояние растения-хозяина и усло- вия окружающей среды. Некоторые растения могут служить бессимптомными носителями вироидов. На- пример, вироид веретеновидности клубней картофеля встречается в основном в декоративных растениях [12]. Несмотря на крайнюю простоту строения, вы- зываемые вироидами болезни растений столь же разнообразны, как вызываемые вирусами растений. Так как вироиды не кодируют белков, их действие на растение должно быть следствием непосредствен- ного взаимодействия вироидной РНК и содержимого клетки-хозяина. Анализ молекулярных химер, скон- струированных из вироидов семейства Pospiviroidae с различной выраженностью патогенности, показал, 212 2 (62) - 2018 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Обзоры что выраженность симптомов заболеваний зависит от сложных взаимодействий, в которых участвуют три из пяти доменов вироидной РНК. Изменения последо- вательности нуклеотидов в домене патогенности (P) может изменить инфективность вироида и степень выраженности симптомов. Например, некоторые му- тации, усиливающие спаривание оснований в этом домене, снижают степень проявления симптомов [6]. Молекулярный механизм, с помощью которого вироиды вызывают заболевания у растений, все-таки остаётся окончательно невыясненным. Было высказа- но предположение, что первыми мишенями вироида являются нуклеиновые кислоты и белки клетки-хозя- ина. Геномы некоторых вироидов содержат участки, комплементарные некоторым клеточным РНК. В связи с этим предполагается, что заболевание начинается из-за ингибирования функций этих клеточных РНК или их разрезания, направляемого вироидной РНК. Например, последовательность части РНК вироида ВВКК имеет сходства с последовательностью РНК U1 млекопитающих (эта РНК участвует в сплайсин- ге), а некоторые вироиды могут комплементарно спариваться с 7S рРНК. Однако сложно объяснить, как изменение нескольких нуклеотидов может пре- вратить высокопатогенный вироид в слабый, так как эти изменения обычно не располагаются в тех участ- ках, которые, как предполагается, гибридизуются с клеточными РНК [8]. Патогенность вироидов может также быть и результатом мимикрии на молекулярном уровне. Из-за особенностей структуры или последователь- ности нуклеотидов вироидная РНК может замещать собой некоторые клеточные РНК. В вироидном патогенезе также может быть задействована РНК- интерференция. Растения используют механизмы РНК-сайленсинга (подавление экспрессии генов) для защиты от вирусных инфекций. Ферменты клетки могут распознавать чужеродные дцРНК или оцРНК с развитой пространственной структурой и разрезать их на малые интерферирующие РНК (siРНК) длиной 21-26 нуклеотидов. В заражённых растениях были выявлены малые РНК, идентичные участкам виро- идной РНК, и показано, что эти siРНК образовались в результате работы ферментов клетки после про- никновения вируса. Развитие симптомов вироидной инфекции может быть обусловлено активацией или отрицательной регуляцией клеточных генов-мишеней под действием siРНК, однако к настоящему моменту не было идентифицировано специфических генов- мишеней [7]. С другой стороны, возможно, существуют белки клетки-хозяина, которые распознают и взаимодей- ствуют с различными вироидными структурами. ДцРНК-зависимая протеинкиназа (PKR) млекопита- ющих активируется вироидом ВВКК, а её вторичная структура напоминает таковую дцРНК. Была показана связь между уровнем активации этого фермента и степенью выраженности симптомов заболевания у растения. Активированная PKR фосфорилирует аль- фа-субъединицу эукариотического фактора инициации синтеза белка, в результате чего происходит ингибирование синтеза белка в клетке. Активация растительного гомолога PKR может запускать виро- идный патогенез, поскольку в клетках млекопитающих активность PKR индуцируется интерферонами и акти- вируется дцРНК [7]. В 2016 г. было показано, что вироид HSVd вызы- вает деметилирование генов рибосомальной РНК (рРНК) в клетках листьев огурца, вызывая усиленное образование рРНК. Симптомы проявляются не только в строении спорофита, но и у гаметофита. Явление кросс-защиты имеет место между различными штам- мами одного вироида или вироидами с очень близки- ми геномными последовательностями. Растение, ин- фицированное одним вироидом, не даёт возможность реплицироваться и вызывать заболевание другому вироиду. Это напоминает вирусную интерференцию, при которой присутствие в клетке одного вируса подавляет репликацию другого вируса. Механизм кросс-защиты у вироидов неизвестен. Согласно одной из гипотез, для репликации, транспорта из клетки в клетку и накопления необходим ограниченный фактор клетки-хозяина. Различное сродство вироидных РНК к этому вироиду может определять, какой из вироидов, одновременно попавших в клетку, будет преобладать; кроме того, взаимодействие вироидной РНК с этим фактором может определять его патогенность [12]. Ряд РНК-содержащих вирусов растений под- держивает репликацию сателлитных РНК, предпо- ложительно давая собственную РНК-зависимую РНК-полимеразу для репликации сателлитных РНК и капсидные белки для формирования капсида сател- литных РНК. Присутствие сателлитных РНК может оказывать влияние на репликацию соответствующего вспомогательного вируса и модулировать симптомы вызываемого им заболевания. Судя по имеющимся сходствам, вироиды и вироид-подобные сатиллитные РНК произошли от общего предка. Одним из таких примеров является вирус гепатита дельта (HDV) [7]. HDV - уникальный патоген человека, который име- ет ряд общих черт с вироидами и вироид-подобными сателлитными РНК растений. Высказано предполо- жение, что HDV произошёл от примитивной вироид- подобной РНК через захват клеточного транскрипта. Этот патоген, передающийся с кровью, реплициру- ется в печени и часто вызывает скоротечный гепатит у приматов и других млекопитающих. Вирус гепатита дельта также может быть связан с развитием рака печени. Он обнаруживается только в присутствии ви- руса гепатита B и использует белок оболочки вируса гепатита B (S-антиген) для упаковки своего генома, представленного РНК. Поскольку вирусу гепатита дельта необходим вирусный белок для упаковки, он считается РНК-сателлитом вируса гепатита B [1, 3, 5]. Если считать, что вироиды появились миллиарды лет назад, то наверняка их можно найти не только в окультуренных растениях. Вироиды были открыты только потому, что стали изучать причину порчи растений. Скорее всего за пределами сельскохо- зяйственных растений можно обнаружить много ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ 2 (62) - 2018 213 Обзоры новых видов. Дикие растения могут служить тайным прибежищем для вироидов, откуда они время от времени переходят на культурные растения, вызывая болезни. В растения вироиды могли попасть вместе с цианобактериями - еще в те времена, когда кон- таминировали предков одноклеточных водорослей и превратились в хлоропласты. Если цианобактерии в древности служили хозяевами для выживших пред- ставителей мира РНК, то вероятно обнаружение вироидов и в современных цианобактериях. Это дает возможность гипотетически предположить, что вироиды могут находиться в самых разнообразных овощах, фруктах и поступать в организм человека. Резюмируя вышеизложенное, можно сделать следу- ющие предварительные выводы о влиянии вироидов на организм человека: 1. Вироиды, как и вирусы, не могут самостоятельно размножаться, но обнаружена способность ряда ви- роидов к размножению и без белков клетки-хозяина. 2. У вироидов обнаружена способность вызывать заболевания только у чувствительных к ним растений. 3. Вироидам свойственен более выраженный механизм нарушения генетической информации хо- зяина, чем у вирусов, что в итоге приводит к болезни растения-хозяина. К сожалению, жизненный цикл вироида внутри клетки-хозяина остается практически не изученным, что не дает возможности смоделировать развитие инфекционного процесса или предположить другие его иммунопатогенетические эффекты на организм человека. Вироиды по своим биологическим свойствам весьма близки к прионам, которые отличаются дли- тельным инкубационным периодом и воздействием на центральную нервную систему.

About the authors

A V Moskalev

Email: sofiarm@yandex.ru

V B Sboychakov

A V Apchel

N V Tsygan

References

Supplementary files