Effects of platelet-rich plasma in the treatment of androgenetic alopecia

E. E.  Pakhomova; Пахомова Е. Е.; I. O.  Smirnova; Смирнова И. О.

doi:10.17816/brmma20689

Эффекты плазмы, обогащенной тромбоцитами, в лечении андрогенетической алопеции

Авторы: Пахомова Е.Е.¹^,2, Смирнова И.О.¹
Учреждения:
1. Санкт-Петербургский государственный университет
2. Трихологический центр здоровья и лечения волос
Выпуск: Том 21, № 3 (2019)
Страницы: 86-91
Раздел: Клинические исследования
Статья получена: 17.02.2020
Статья опубликована: 15.09.2019
URL: https://journals.eco-vector.com/1682-7392/article/view/20689
DOI: https://doi.org/10.17816/brmma20689
ID: 20689

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Представлены результаты клинического и иммуногистохимического исследования эффектов богатой тромбоцитами плазмы на морфологические показатели роста волос, микроциркуляцию и пролиферативную активность клеток волосяных фолликулов у 25 мужчин, страдающих андрогенетической алопецией I–IV стадии по шкале Норвуда – Гамильтона. Все пациенты получали инъекции богатой тромбоцитами плазмы, которую вводили интрадермально по 0,15 мл на одну инъекцию. Курс лечения состоял из 4 процедур с интервалом в 4 недели. Клиническую эффективность оценивали по динамике морфометрических показателей роста волос. Биоптаты кожи для иммуногистохимического исследования на парафиновых срезах были получены от 8 пациентов, использовали стандартный двухэтапный протокол с демаскировкой антигена. Установлено, что терапия плазмой, богатой тромбоцитами, имеет выраженную клиническую эффективность, состоящую в достоверном (p=0,000067) увеличении на 12% плотности волос и среднего диаметра волос (p=0,001947), снижении доли веллусных волос на 17% (p=0,002225) и доли телогеновых волос на 16% (p=0,02836). При иммуногистохимическом исследовании биоптатов кожи головы после лечения значимо увеличились абсолютные и относительные значения площади экспрессии CD34 и β-catenin (∆287%, p=0,0001; ∆325%, p=0,0003 и ∆165%, p=0,0306; ∆96%, p=0,0018 соответственно). Таким образом, важными механизмами воздействия плазмы, богатой тромбоцитами, у пациентов, страдающих андрогенетической алопецией, являются улучшение микроциркуляции и пролиферации клеток волосяного фолликула, а также пролонгирование фазы анагена.

Ключевые слова

андрогенетическая алопеция, интрадермальные инъекции богатой тромбоцитами плазмы, морфология волос, иммуногистохимическое исследование волос, Beta-catenin, фототрихограмма, микроциркуляция волосяного фолликула, анаген, телоген, веллус

Полный текст

Введение. Андрогенетическая алопеция (АГА) является одним из самых распространенных типов потери волос. В качестве альтернативной методики стимуляции роста волос используется инъекционное введение плазмы, обогащённой тромбоцитами (богатая тромбоцитами плазма, БоТП), в область алопеции. Основанием для применения БоТП являются результаты исследований, полученных в культуре волосяного фолликула (ВФ) на моделях в пробирке, которые позволяют предполагать, что БоТП продлевает фазу анагена за счет ингибирования апоптоза, повышает микроциркуляцию и пролиферацию клеток волосяного фолликула, в том числе в таких важных регуляторных зонах, как выпуклость наружной волосяной оболочки и дермальный сосочек [12, 13, 15]. В отдельных исследованиях показаны ее эффекты в лечении пациентов, страдающих АГА, проявляющиеся в снижении выпадения волос и увеличении плотности волос [3, 5, 7, 10, 14, 16].

Положительный клинический эффект БоТП предположительно связывают с тромбоцитарными факторами роста. Последние, связываясь с чувствительными к ним рецепторами, активируют сигнальные пути, влияющие на цикл роста волос и пролиферацию клеток ВФ [20]. Сигналы тромбоцитарного фактора роста вовлечены в эпидермально-мезенхимальное взаимодействие, необходимое для формирования канала волос и роста мезенхимальной ткани [19]. Фактор роста эндотелия сосудов обладает митогенной активностью по отношению к сосудистым эндотелиальным клеткам и является важным медиа- тором роста ВФ, так как ангиогенез в течение анагеновой фазы роста волос считается одним из важных условий, необходимых для их роста и увеличения фолликула в размерах [11, 23]. Инсулиноподобный фактор роста регулирует митогенез. Фактор роста фибробластов является стимулятором роста клеток широкого спектра действия, фактор роста кератиноцитов стимулирует пролиферацию кератиноцитов. Хотя трансформирующий фактор роста бета-1 и эпидермальный фактор роста оказывают негативное воздействие на рост волос, однако «суммарный» эффект всех факторов роста оказывает положительное влияние на рост волос [8].

Фундаментальную роль в течение всей жизни циклической трансформации ВФ играют сигнальные белки, которые функционируют как биологические переключатели во время различных фаз роста волос, контролируя активную фазу анагена (например β-catenin) [18]. Z.J. Li et al. [13] указывают на то, что БоТП индуцирует пролиферацию клеток дермального сосочка путем активирования сигнальных путей Wnt/ β-catenin и фактора роста фибробластов 7 (FGF-7). Авторами было показано, что инициирование катагена с последующим переходом в телоген частично происходит в результате специфического ингибирования канонической передачи сигналов Wnt/β-catenin в кератиноцитах волосяных фолликулов. Следовательно, сигнальный путь Wnt/β-catenin с реализацией накопления β-катенина в ядре клетки с последующей активацией транскрипции ДНК играет важную роль в развитии ВФ и поддержании цикла роста волос. V. Cervelli et al. [5, 6] на образцах кожи волосистой части головы (ВЧГ), используя антитела к антигену Ki67, установили влияние БоТП на пролиферацию кератиноцитов. Известно, что антиген Ki67 достоверно ассоциирован с фазами клеточного цикла, так как его экспрессия появляется во время G1 фазы, нарастает в течение клеточного цикла и резко уменьшается после митоза. Антиген Ki67 имеет короткий период полужизни, не превышающий 1,5 ч, и не накапливается в покоящихся клетках. Таким образом, при иммуногистохимических исследованиях антитела к антигену Ki67 выявляют пролиферирующие клетки на разных фазах цикла и отражают весь пул делящихся клеток. V. Cervelli et al. [5, 6] после лечения, по сравнению с исходными данными, наблюдали повышение количества базальных кератиноцитов, экспреccирующих антиген Ki67. Сведения об эффектах БоТП на пролиферативную активность клеток ВФ и уровень экспрессии β-catenin как отражении активности сигнальных путей Wnt/β-catenin получены в пробирке или на животных [12, 13, 15, 18], на образцах кожи ВЧГ исследования не проводились. Кроме того, V. Cervelli et al. [5] оценивали также микроциркуляцию после применения БоТП с использованием антител к CD31 и наблюдали некоторое увеличение количества микрососудов в ВФ.

L.E. Sidney et al. [17] показали, что CD34 связан с пролиферирующими эндотелиальными клетками и проявляется во время фазы анагена, а D. Yilmazer et al. [24] выявили, что плотность сосудов, определяемых с помощью окрашивания CD34, адекватно коррелирует с распределением и интенсивностью экспрессии фактора роста эндотелия сосудов. Ангиогенез во время фазы анагена считается одним из важных факторов, способствующих росту волос и увеличению фолликула в размерах [11, 23]. CD34 преимущественно рассматривается как маркер гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников, а также сосудистых эндотелиальных клеток- предшественников и эмбриональных фибробластов. Нециркулирующие взрослые CD34+-эндотелиальные клетки расположены в более мелких кровеносных сосудах, в то время как большинство эндотелиальных клеток больших вен и артерий являются CD34–. В организме человека CD34+ расположены супрабульбарно, а также в коже между волосяными фолликулами, в базальных клетках межфолликулярного эпидермиса. На протяжении волосяного цикла присутствие CD34 проявляется во время фазы анагена, но не во время фаз катагена и телогена [17]. Полагают, что функция CD34 относится только к эпителиальным клеткам, которые пролиферируют, а также имеют отношение к адгезии клеток корневой оболочки к окружающей строме. Человеческие CD34+ клетки не находятся в зоне выпуклости с другими стволовыми клетками, а расположены в области ВФ, которая демонстрирует наиболее клоногенную активность.

Исследований по оценке микроциркуляции после применения БоТП с использованием антител к CD34 на образцах кожи нами не найдено. Поэтому изучение предполагаемых механизмов действия БоТП и ее лечебных эффектов у пациентов, страдающих АГА, является актуальным.

Цель исследования. Оценить эффекты плазмы, богатой тромбоцитами, на морфологические показатели роста волос, микроциркуляцию и пролиферативную активность клеток волосяных фолликулов у пациентов, страдающих АГА.

Материалы и методы. Под наблюдением находилось 25 пациентов в возрасте от 20 до 43 лет (средний возраст 30±2,5 года). У 23 (91,3%) пациентов диагностирована II–IV степень тяжести АГА по шкале Гамильтона – Норвуда [4], у 2 пациентов – I степень. Средняя длительность заболевания составляла 3,4±0,97 года. Пациенты не различались по анамнезу и морфометрическим показателям роста волос.

Для получения БоТП от каждого пациента путем венопункции забирали 18 мл крови в 2 пробирки с антикоагулянтом (3,8% цитрат натрия в соотношении 1:9) с последующим двукратным центрифугированием на скорости 1800 и 2500 об/мин (5 и 10 мин соответственно). В качестве БоТП использовали 2 мл нижней части супернатанта из каждой пробирки, который активировали 10% раствором хлористого кальция в соотношении 1:20. В ВЧГ внутрикожно вводили приблизительно по 0,15 мл активированного супернатанта на одну инъекцию. От всех пациентов получено информированное согласие на обследование и лечение. Пациенты хорошо переносили инъекции БоТП, лишь у двоих (9%) отмечалась незначительная болезненность в местах инъекций, что не являлось поводом для прекращения терапии ни в одном случае.

Клиническую эффективность терапии оценивали по динамике морфометрических показателей роста волос. Трихологическое исследование выполняли с помощью цифровой видеокамеры «Aramo S» фирмы «Аram Huvis Co., Ltd.» (Корея) и компьютерной программы TrichoSciencePro v1.3RUS (Россия). Плотность волос определяли на 1 см2, долю веллусных и телогеновых волос – в %, средний диаметр всех волос – в мкм. Точки контроля были помечены татуаж- ной меткой – пигментом «Burgundy ZX-BP-5» фирмы «Biotouch» (Соединенные Штаты Америки – США) – и находились в теменной зоне, приблизительно на 2 см ближе к центру алопеции от границы поредения волос. Непосредственно перед проведением фототрихограммы волосы в области исследования для улучшения контрастности изображения были прокрашены черной краской для волос «RefectoCil».

Биоптаты кожи для гистологического исследования были получены от 8 пациентов до и после лечения. Биопсию кожи проводили под местной анестезией 1% раствором лидокаина с эпинефрином для достижения анальгезии и уменьшения кровотечения. Забор материала проводили панчем для биопсии диаметром 4 мм [21, 22]. Кусочки кожи фиксировали в 10% нейтральном формалине (рН 7,2), обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и заливали в парафин по стандартной методике.

Иммуногистохимическое исследование проводили на парафиновых срезах толщиной 5 мкм, которые помещали на предметные стекла, покрытые пленкой из поли-L-лизина фирмы «Sigma» (Япония).

Для оценки пролиферативной активности клеток ВФ использовали моноклональные антитела к Beta-catenin фирмы «Сell signaling technology», 1:100 (США). Для оценки площади экспрессии CD34 как отражения микроциркуляции и пролиферации клеток ВФ использовали моноклональные антитела к CD34 фирмы «Сell signaling technology», 1:50 (США). Для проведения исследования использовали протокол, рекомендованный производителем.

Цифровая микроскопия и морфометрия включала качественную и количественную оценку результатов иммуногистохимического и иммунофлуоресцентного исследований на микрофотографиях, полученных с помощью системы фиксации микроскопических изображений, состоящей из микроскопа «Olympus» CX31, цифровой камеры «Olympus» BX46 и программного обеспечения CellSens 47 Entry. Из фотосъемки исключали поля зрения, содержащие дефекты ткани, дефекты окрашивания и артефакты. Фотосъемку производили при увеличении ×400, ×200 (окуляр ×10, объектив ×40, ×20). Определение количества иммунопозитивных клеток и площади экспрессии исследуемых молекул проводили в 10 рандомизированных полях зрения при увеличении ×400 не менее чем в 3 срезах от каждого образца. Долю занимаемой экспрессии изучаемого маркера рассчитывали с помощью программы ВидеоТест-Морфология 5.0 («Видеотест», Россия) [2].

В каждом срезе оценивали общую площадь препарата, общую площадь экспрессии белка, относительную площадь экспрессии (вычисляли как отношение площади иммунопозитивных клеток к общей площади препарата).

Статистическую обработку и визуализацию результатов осуществляли при помощи языка программирования R и библиотек «Coin» и «Ggplot2». В качестве показателя центра распределения применяли среднеарифметическое, так как распределения соответствуют нормальному по критерию Шапиро – Уилка. Устойчивость оценок отражена при помощи доверительных интервалов при γ=0,95. Для проверки связи между номинативными (сгруппированными) данными применяли точный критерий Фишера (строгий аналог критерия хи-квадрат для маленьких выборок). Для проверки связи между количественными данными применяли непараметрический парный t-критерий Уилкоксона. Для всех статистических критериев рассчитывали p-value – вероятность ошибки при отклонении нулевой гипотезы (вероятность ошибки первого рода), p<0,05 считали статистически значимой [1].

Результаты и их обсуждение. В ходе лечения пациентов БоТП отмечена выраженная клиническая эффективность методики, которая состояла в достоверном увеличении плотности и среднего диаметра волос на 12% (p=0,000067 и p=0,001947 соответственно); снижении доли веллусных волос на 17% (p=0,002225), доли телогеновых волос на 16% (p=0,02836), таблица 1, рисунок 1.

Таблица 1. Динамика показателей роста волос

Показатель	До лечения	После лечения	Относительные изменения
Показатель	До лечения	После лечения	абс.	А (%)	р-value
Плотность волос на см²	381,5±45,4	426,1±50,1	44,6	12%	0,000067
Доля веллусных волос, %	49,6±7,3	41,0±7,7	8,6	-17%	0,002225
Средний диаметр всех волос, мкм	39,8±3,5	44,4±4,5	4,6	12%	0,001947
Доля телогеновых волос, %	42±6,4	35,3±7,0	-6,8	-16%	0,02836

Рис. 1. Фототрихограмма: а, в – до лечения; б, г – через 4 месяца после лечения, ув. ×60. Наблюдается увеличение плотности и диаметра волос

При иммуногистохимическом исследовании образцов кожи ВЧГ после лечения достоверно увеличились абсолютные и относительные значения площади экспрессии CD34 (∆287%, p=0,0001 и 325%, p=0,0003 соответственно), а также абсолютные и относительные значения площади экспрессии β-catenin (∆165%, p=0,0306 и ∆96%, p=0,0018 соответственно), таблица 2, рисунки 2, 3.

Таблица 2. Результаты иммуногистохимического исследования образцов кожи ВЧГ

Показатель	До лечения	После лечения	Относительные изменения		р-value
Показатель	До лечения	После лечения	абс.	А (%)	р-value
CD34
Общая площадь, мкм²	70883±8420	65630±7928	-5253	-7%	0,3419
Площадь экспрессии белка, мкм²	2513±919	9721±2413	7208	287%	0,0001
Относительная площадь, %	3,6±1,20	15,4±4,3	11,8	325%	0,0003
ß-catenin
Общая площадь, мкм²	24444±6758	28433±9093	3989	16%	0,4625
Площадь экспрессии белка, мкм²	2727±1584	7238±3812	4511	165%	0,0306
Относительная площадь, %	11,3±4,2	22,2±5,3	10,9	96%	0,0018

Рис. 2. Экспрессия CD34: а – до лечения; б – после лечения, ув.×400

Рис. 3. Экспрессия белка β-катенина: а – до лечения; б – после лечения, ув. ×400

Увеличение площади экспрессии CD34 отражает улучшение микроциркуляции и пролиферации клеток ВФ в течение анагена.

Повышение уровня белка β-катенина в образцах кожи ВЧГ после применения БоТП демонстрирует активацию Wnt/β-catenin-сигнального пути и ассоциировано с усилением пролиферации клеток волосяного матрикса, ростом стержня волоса, формированием эпителия волос и дифференцировкой стволовых клеток ВФ в течение анагена.

Заключение. Увеличение экспрессии белка β-катенина и CD34 на фоне БоТП характеризует улучшение микроциркуляции и пролиферации клеток ВФ, положительно влияющих на качественные и количественные показатели роста волос. Полученные нами результаты клинического и иммуногистохимического исследования согласуются с данными о молекулярных и биологических эффектах БоТП на ВФ, полученными на моделях в пробирке. Клиническими проявлениями являются увеличение плотности волос, продолжительности фазы роста, толщины стержней волос и переход из состояния веллуса в терминальное.

Об авторах

Е. Е. Пахомова

Санкт-Петербургский государственный университет; Трихологический центр здоровья и лечения волос

Автор, ответственный за переписку.
Email: spbclv@mail.ru
Россия, Санкт-Петербург; Санкт-Петербург

И. О. Смирнова

Санкт-Петербургский государственный университет

Email: spbclv@mail.ru
Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Носовский, А.М. Статистика малых выборок в медицинских исследованиях / А.М. Носовский [и др.] // Росс. мед. журн. – 2013. – № 6. – С. 57–60.
ВидеоТест-Морфология 5.0: руководство пользователя. – СПб.: ВидеоТест, 2007. – 85 с.
Betsi, E.E. Platelet-rich plasma injection is effective and safe for the treatment of alopecia / E.E. Betsi [et al.] // Eur. J. Plast. Surg. – 2013. – Vol. 36 – P. 407–412.
Blume-Peytavi, U. Hair Growth and Disorders / U. Blume-Peytavi, D.A. Whiting, R.M. Trüeb // Springer. – 2008. – 564 p.
Cervelli, V. The Effect of Autologous Activated Platelet Rich Plasma Injection on Pattern Hair Loss: Clinical and Histomorphometric Evaluation / V. Cervelli [et al.] // Biomed Res Int. – 2014. – Article ID 760709. – 9 p.
Gentile, P. Evaluation of Not-Activated and Activated PRP in Hair Loss Treatment: Role of Growth Factor and Cytokine Concentrations Obtained by Different Collection Systems / P. Gentile [et al.] // Int. J. Mol. Sci. – 2017. – Vol. 18 (2). – P. 408–416.
Gkini, M.A. Study of platelet-rich plasma injections in the treatment of androgenetic alopecia through an one-year period / M.A. Gkini [et al.] // J. Cutan. Aesthet. Surg. – 2014. – Vol. 7. – P. 213–219.
Greco, J. The effects of autologous platelet rich plasma and various growth factors on non-transplanted miniaturized hair / J. Greco, R. Brandt. // Hair Transplant Forum International. – 2009. – P. 49–50.
Kang, J.-S. The effect of CD34+ cell-containing autologous platelet-rich plasma injection on pattern hair loss: a preliminary study / J.-S. Kang [et al.] // J. Eur. Ac. Dermatol. and Venereol. – 2014. – Vol. 28 (1). – P. 72–79.
Khatu, S.S. Platelet-rich plasma in androgenic alopecia: Myth or an effective tool / S.S. Khatu [et al.] // J. Cutan. Aesthet. Surg. – 2014. – Vol. 7. – P. 107–110.
Kozlowska, U. Expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in various compartments of the human hair follicle / U. Kozlowska [et al.] // Arch. Dermatol. Res. – 1998. – Vol. 290 (12). – P. 661–668.
Li, W. Subcutaneous injections of platelet-rich plasma into skin flaps modulated proangiogenic gene expression and improve survival rates / W. Li [et al.] // Plast. Reconstr. Surg. – 2012. – Vol. 129 (4). – P. 858–866.
Li, Z.J. Autologous platelet-rich plasma: a potential therapeutic tool for promoting hair growth / Z.J. Li [et al.] // Dermatol Surg. – 2012. – Vol. 38 (7 Pt 1). – P. 1040–1046.
Park, K.Y. Letter: Platelet-rich plasma for treating male pattern baldness / K.Y. Park [et al.] // Dermatol. Surg. – 2012. – Vol. 38 (12). – P. 2042–2044.
Rinaldi, F. The role of up-stimulation of growth factors in hair transplantation: improve the revascularization of transplanted hair growth mediated by angiogenesis / F. Rinaldi, E. Sorbellini, P. Bezzola // Hair Transplant Forum Int. – 2007. – Vol. 17 (4). – P. 125–127.
Sclafani, A.P. Platelet-rich fibrin matrix (PRFM) for androgenetic alopecia / A.P. Sclafani // Facial. Plast. Surg. – 2014. – Vol. 30. – P. 219–224.
Sidney, L.E. Concise review: evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors / L.E. Sidney [et al.] // Stem Cells. – 2014. – Vol. 32 (6). – P. 1380–1389.
Sohn, K.C. Pitx2, a beta-catenin-regulated transcription factor, regulates the differentiation of outer root sheath cells cultured in vitro / K.C. Sohn [et al.] // J. Dermatol. Sci. – 2009. – Vol. 54 (1). – P. 6–11.
Takakura, N. Involvement of platelet-derived growth factor receptor-alpha in hair canal formation / N. Takakura [et al.] // J. Invest. Dermatol. – 1996. – № 107 (5). – P. 770–777.
Uebel, C.O. The role of platelet plasma growth factors in male pattern baldness surgery / C.O. Uebel [et al.] // Plast. Recon- str. Surg. – 2006. – Vol. 118. – P. 1458–1467.
Whiting, D.A. Diagnostic and predictive value of horizontal sec- tions of scalp biopsy specimens in male pattern androgenetic alopecia / D.A. Whiting // J. Am. Acad. Dermatol. – 1993. – Vol. 28. – P. 755–763.
Whiting, D.A. Hair Growth and Disorders. Histology of the Human Hair Follicle / D. Whiting [et al.] // Springer – Verlag Berlin, Heidelberg, 2008. – P. 107–123.
Yano, K. Control of hair growth and follicle size by VEGF-mediated angiogenesis / K. Yano [et al.] // J. Clin. Invest. – 2001. – № 107 (4). – P. 409–417.
Yilmazer, D. A comparison of the vascular density of VEGF expression with microvascular density determined with CD34 and CD31 staining and conventional prognostic markers in renal cell carcinoma / D. Yilmazer, Ü. Han, B. Önal // Int. Urol. Nephrol. – 2007. – Vol. 39. – P. 691–698.