Отправить статью по E-mail Роль иммунодепрессивных состояний в отягощении изолированных радиационных и комбинированных химиолучевых поражений
- Авторы: Антушевич А.Е.1, Климов А.Г.2, Гребенюк А.Н.3, Гаврилюк Б.Л.1, Болехан А.В.1, Богданова Е.Г.1, Апчел В.Я.1,4, Аржавкина Л.Г.1, Крючкова А.С.1
-
Учреждения:
- Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова
- Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет
- Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова
- Российский государственный педагогический университет им. А.И. Герцена
- Выпуск: Том 21, № 3 (2019)
- Страницы: 132-136
- Раздел: Экспериментальные исследования
- Статья получена: 17.02.2020
- Статья опубликована: 15.09.2019
- URL: https://journals.eco-vector.com/1682-7392/article/view/20700
- DOI: https://doi.org/10.17816/brmma20700
- ID: 20700
Цитировать
Полный текст
Аннотация
В экспериментах на беспородных половозрелых белых мышах-самцах массой 16–18 г изучена устойчивость к изолированному лучевому и комбинированному химиолучевому поражению. Моделирование лучевого поражения осуществляли путем γ-облучения животных в дозе 4,5 Гр (мощность дозы – 1,24 Гр/мин; расчетная летальная доза – 20% при 30-суточном наблюдении), комбинированного химиолучевого поражения – облучением мышей в той же дозе на фоне сформировавшегося цитостатического иммунодефицита после однократного введения животным циклофосфамида в дозе 100 мг/кг. Иммунодефицит моделировали в двух вариантах: с преимущественным угнетением Т-клеточного (с помощью конканавалина А) или В-клеточного (с помощью продигиозана) иммунитета. Оценивали выживаемость и среднюю продолжительность жизни погибших животных, их гематологический и иммунный статус. Установлено, что облучение, приводящее к гибели 20% мышей с исходно интактной иммунной системой, на фоне Т-клеточного иммунодефицита сопровождалось ростом летальности до 90% в первые трое суток после облучения. Летальность облученных мышей с В-иммунной недостаточностью составляла в среднем 60%. Выявлено, что резистентность к лучевой травме, вызванной γ-облучением, во многом зависит от типа иммунного реагирования. Наиболее чувствительным к этому виду воздействия является Т-звено иммунитета. Угнетение иммунологической реактивности в эксперименте приводило к существенному повышению чувствительности организма к радиационной травме и эндотоксину. Наиболее выраженные изменения наблюдались на модели Т-клеточного иммунодефицита, что свидетельствует о значимости Т-клеточного контроля в патогенезе постлучевой аутоинтоксикации.
Полный текст
Введение. Особенности оказания догоспитальной медицинской помощи в условиях поражения населения при техногенных радиационных авариях и катастрофах требуют целенаправленного совершенствования прежде всего средств патогенетической и симптоматической терапии. Анализ результатов экспертных оценок, возможных причин развития патологии при поражениях экстремальными факторами физической (радиационной) и химической природы указывает на то, что основную угрозу для жизни пораженных будут представлять аутоинтоксикация и сепсис, обусловленные иммунологическими и гематологическими нарушениями [1, 2]. Вопросы профилактики токсемии и контроля за развитием инфекции на сегодняшний день являются чрезвычайно актуальными и нерешенными даже применительно к изолированным формам поражений (обширные повреждения мягких тканей, термические ожоги, острая лучевая болезнь (ОЛБ), отравления высокотоксичными веществами и др.). При ОЛБ судьба облученного организма определяется прежде всего глубиной и длительностью лейко- и тромбоцитопении, которые в свою очередь зависят от сохранившихся после облучения стволовых кроветворных клеток [3, 4]. Именно это обстоятельство и определяет тактику лечения ОЛБ, которая базируется на проведении поддерживающей, заместительной и стимулирующей терапии – применении средств лечения инфекционных и геморрагических осложнений, а также использовании препаратов и процедур, направленных на ускорение восстановления угнетенного радиацией гемо- и иммунопоэза [3, 7, 8].
Цель исследования. Изучить роль нарушения процессов гемо- и иммуногенеза в формировании изолированных (радиационных) и комбинированных химиолучевых поражений различной степени тяжести.
Материалы и методы. Эксперименты выполнены на нелинейных половозрелых белых мышах-самцах массой 16–18 г. Животных получали из питомника «Рапполово» (Ленинградская обл.). В течение 2 недель после получения животных выдерживали в карантине.
Лучевое поражение осуществляли путем γ-облучения животных на установке «ИГУР-1» в дозе 4,5 Гр (расчетная летальная доза – 20% при 30-суточном наблюдении) с мощностью дозы 1,24 Гр/мин. Моделирование химической компоненты комбинированного поражения осуществляли путем внутрибрюшинного введения мышам цитостатика циклофосфамида в дозе 100 мг/кг. Комбинированное химиолучевое поражение осуществляли облучением мышей в дозе 4,5 Гр на фоне сформировавшегося цитостатического иммунодефицита после однократного введения животным циклофосфамида в дозе 100 мг/кг.
В работе были использованы следующие химические соединения и фармакологические препараты:
– циклофосфамид фирмы «Baxter Oncology» (Германия), широко используемый в экспериментальных системах в качестве иммунодепрессанта;
– продигиозан производственного объединения
«Мосмедпрепараты им. Л.Я. Карпова» (Россия);
– липополисахарид (ЛПС) из C. Marcescens;
– конканавалин А (КонА) фирмы «ПанЭко» (Рос- сия) – стерильный лиофилизированный порошок по 5 мг во флаконе.
Моделирование иммунодефицита проводили по методике Т.В. Кондратьевой с соавт. [6] в двух вариантах: преимущественным угнетением Т-клеточного или В-клеточного иммунитета. За двое суток до однократной внутрибрюшинной инъекции циклофосфамида в дозе 100 мг/кг мышам внутрибрюшинно вводили стимулятор Т-клеток (КонА – 10 мг/кг) или В-клеток (ЛПС – 0,5 мг/кг). Исследования проводили спустя 7 суток после применения циклофосфамида. Оценивали выживаемость и среднюю продолжительность жизни мышей, их гематологический и иммунный статус. Гематологические исследования проводили с помощью унифицированных стандартных методик.
Иммунный статус животных оценивали по следующим показателям: относительная масса тимуса, селезенки и лимфоузлов, количество лейкоцитов в крови, число антителообразующих клеток (АОК) по Ерне и Нордин [11] и количество розеткообразующих клеток (Е-РОК) в селезенке по Zaalberg [15]. Условия иммунизации такие же, как и при оценке количества АОК.
Мышей иммунизировали внутривенным введением эритроцитов барана в количестве 2×108 клеток. АОК определяли через четверо суток после иммунизации [9].
Реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) оценивали после однократной внутривенной иммунизации мышей эритроцитами барана (2×105 клеток) в 0,05 мл физиологического раствора. Для выявления сенсибилизации на 5-е сутки мышам вводили 2×108 эритроцитов барана в 0,05 мл физиологического раствора в подушечку задней лапы. В контралатеральную лапу вводили физиологический раствор в том же объеме. Местную воспалительную реакцию оценивали через 24 ч по различию массы опытной (Ро) и контрольной (Рк) лап. Для каждого животного вычисляли индекс реакции [11].
Полулетальную дозу эндотоксина определяли с помощью системы пробит-анализа по методике Литчфильда и Уилкоксона [12]. Процент выживших животных со значимым интервалом для вероятности 95% определяли с помощью таблиц В.С. Генеса [5]. Значимость различий других исследуемых показателей определяли по критериям Стьюдента и Фишера [12].
Результаты и их обсуждение. Введение экспериментальным животным цитостатика в дозе 100 мг/ кг сопровождалось выраженным угнетением костномозгового кроветворения. Облучение животных в нелетальных дозах вызывало гемодепрессивное состояние, наиболее выраженное на 10-е сутки после радиационного воздействия с последующей нормализацией к 20-м суткам. С учетом этих данных представлялось важным изучение устойчивости экспериментальных животных к комбинированному поражению (радиационно-химическому), то есть определение реакции организма на γ-облучение на фоне сформировавшегося цитостатического иммунодефицита. Через двое суток после введения циклофосфамида животных облучали в дозе 4,5 Гр. Исследования проводили через 5 суток после облучения, каждая группа состояла из 10 мышей (табл. 1).
Таблица 1. Иммунологические показатели у мышей при комбинированном радиационно-химическом поражении
Показатель | Интактные животные | Облучение | Циклофосфамид | Циклофосфамид +облучение |
Масса тимуса, г | 0,065±0,016 | 0,039±0,004* | 0,042±0,005* | 0,02±0,004 |
Масса селезенки, г | 0,240±0,013 | 0,135±0,030* | 0,180±0,04* | 0,120±0,03* |
Лейкоциты, ×109/л | 5,80±0,62 | 3,10±0,28* | 4,40±0,41* | 1,80±0,21* |
Титр антител к эритроцитам барана, ед. в мл | 4600±320 | 1880±120* | 1340±84* | 670±50* |
ГЗТ (индекс реакции, у. е.) | 11,6±1,4 | – | 8,5±1,3* | 8,3±1,4* |
Летальность, % | – | – | 20 | 50 |
Примечание: * – р<0,05 по сравнению с интактными животными.
Установлено, что изолированное воздействие двух повреждающих факторов (химического и радиационного) сопровождалось развитием у животных иммунодепрессивного состояния. Через двое суток после однократного внутрибрюшинного введения животным циклофосфамида в дозе 100 мг/кг относительная масса тимуса и селезенки снизилась более чем в 2 раза по сравнению с интактными животными. Количество лейкоцитов было ниже в среднем на 50% (р<0,05). Количество антител к эритроцитам барана снизилось более чем в 2 раза (р<0,05) по сравнению с контролем. Практически нелетальное облучение на фоне сформировавшегося у животных иммунодефицита усугубляло их состояние и приводило к увеличению летальности с 20 до 50% при 30-суточном наблюдении.
Спустя 5 суток после облучения относительная масса лимфоидных органов у животных была значительно ниже, чем в условиях изолированного воздействия каждого из повреждающих агентов. Аналогичные изменения обнаружены в количестве лейкоцитов, а также способности к антителопродукции в ответ на иммунизацию эритроцитами барана. Следовательно, при данном варианте комбинированного воздействия ведущая роль в иммуносупрессии принадлежит, несомненно, химическому компоненту, который значительно усиливает повреждающее действие радиации. Согласно данным А.К. Гуськовой [4], иммунодепрессивное действие циклофосфамида обусловлено преимущественным снижением численности иммунокомпетентных клеток.
Показано, что использование различных митогенов лимфоидных клеток давало возможность путем последующего введения мышам супрессивной дозы циклофосфамида воспроизводить иммунодефицит преимущественно по Т- или В-клеточному типу. Максимальное снижение функциональной активности иммунокомпетентных клеток наблюдалось на 5–7-е сутки (табл. 2).
Таблица 2. Показатели иммунитета у мышей с Т- и В-клеточным иммунодефицитом
Показатель | Интактные животные | ЦФ-иммунодефицит "-нммунодефицт | ||
КонА+ЦФ (Т-клеточный) | ЛПС+ЦФ (В-клеточный) | ЦФ (контроль) | ||
Масса тимуса, г | 0,062±0,004 | 0,034±0,005^ | 0,056±0,003 ° | 0,055±0,003 ° |
Масса селезенки, г | 0,240±0,060 | 0,270±0,030^ | 0,310±0,050* | 0,246±0,020 |
Лейкоциты, х109/л | 5,08±0.04 | 3,25±0,28^ | 2,65±0,49^ | 1,32±0,33 ° |
Количество АОК/селезенку,х103 | 43,30±1,50 | 8,60±0,36^ | 4,24±0,27 ° ^ | 17,30±1,05^ |
Количество Е-РОК, % | 26,40±4,69 | 3,33±0,76^ | 11,60-3,92^ | 12,00±1,14 ° |
ГЗТ, у. е. | 6,3±1,2 | 1,7±0,3* | 4,7±0,8* | 4,8±1,2* |
Летальность, % | 0±5 | 30±10 | 10±7 | 10±7 |
Примечание: различия по сравнению с интактными животными, * – р<0,05; ° – р<0,01; ^ – р<0,001.
Наиболее выраженное изменение лимфоидного аппарата наблюдалось у мышей с преимущественно Т-клеточным типом иммунной недостаточности. При В-иммунодефиците выявлено выраженное снижение относительной массы тимуса (в среднем на 40%, р<0,05), селезенки (более чем на 30%, р<0,05) и количества лейкоцитов (на 26%, р<0,05), что коррелировало с резким снижением числа Е-РОК (71%, р<0,02). Угнетение предварительно стимулированного пула Т-лимфоцитов привело к отсутствию способности к формированию ГЗТ. Продукция монокинов в ответ на введение индуцирующей дозы ЛПС при обоих типах иммунодефицита была одинаковой. Гибель Т-иммунодефицитных мышей в течение 30 суток составляла в среднем 30%. На модели В-иммуносупрессии, а также при использовании одного циклофосфамида летальность не превышала 10%. Вторичный В-иммунодефицит по сравнению с Т-иммунодефицитом характеризовался преимущественным угнетением (на 50%, р<0,05) числа АОК.
Описанные модели вторичного иммунодефицита были использованы для выяснения значимости Т- и В-систем иммунитета в патогенезе пострадиационного синдрома и эндотоксемии. С этой целью предусматривалось проведение экспериментов по изучению устойчивости мышей с различным типом иммунодефицита к лучевой травме и введению эндотоксина. Установлено, что облучение, приводящее к гибели 20% мышей с исходно интактной иммунной системой, на фоне Т-клеточного иммунодефицита сопровождалось ростом летальности в первые трое суток после облучения до 90% животных, что не позволяло проведить дальнейшие иммунологические эксперименты.
Летальность облученных мышей с В-иммунной недостаточностью составляла в среднем 60% (табл. 3).
Таблица 3. Иммунологические показатели при общем γ-облучении мышей на фоне Т- и В-клеточного иммунодефицита
Показатель | Интактные животные | у-облучение в дозе 4,5 Гр | Облучение+иммунодефицит | |
Т-клеточный (КонА+ЦФА) | B-клеточный (ЛПС+ЦФА) | |||
Масса тимуса, г | 0,062± | 0,028± | - | 0,031± |
Масса селезенки, г | 0,250± | 0,250± | - | 0,180± |
Лейкоциты, х109/л | 6,32± | 3,20± | - | 2,40± |
Количество АОК/ селезенку, х103 | 52,4± | 20,4± | - | 17,6± |
ГЗТ (индекс реакции, у. е.) | 7,5± | 3,1± | - | 2,8± |
Активность ФНО-а, ЕД/л | <80 | 2560± | - | 320± |
Летальность, % | - | 20± | 90± | 60± |
Примечание: различия по сравнению с интактными животными, * – р<0,05; ** –р<0,01; *** – р<0,001.
Основные проявления модифицирующего влияния В-клеточного иммунодефицита на течение лучевого синдрома были аналогичны действию иммунодепрессантов. В условиях В-иммунодефицита у облученных мышей возникала стойкая лейкопения со снижением числа лейкоцитов до 2,4×109/л. Уже к исходу третьих суток в сыворотке крови животных с комбинированной (химиолучевой) травмой также регистрировалась низкая активность опухоленекротизирующего фактора. Tаким образом, состояние повышенной чувствительности к лучевой травме, вызванной иммунодепрессией, во многом зависит от типа иммунного реагирования. Наиболее чувствительным к этому виду воздействия является Т-звено иммунитета.
С учетом патогенетической роли эндотоксинов в раннем постлучевом периоде были проведены эксперименты по оценке устойчивости мышей к ЛПС на фоне Т- и В-клеточного иммунодефицита. Установлено, что иммунодефицит существенно повышал чувствительность мышей к эндотоксину. Наибольшая летальность наблюдалась у животных с недостаточностью иммунитета по Т-клеточному типу (см. табл. 2).
Угнетение иммунологической реактивности приводит к существенному повышению чувствительности организма к радиационной травме и эндотоксину. Наиболее выраженные изменения наблюдались на модели Т-клеточного иммунодефицита, что свидетельствует о значимости Т-клеточного контроля в патогенезе постлучевой аутоинтоксикации. Вероятно, применение средств, положительно влияющих на процессы пролиферации и дифференцировки Т-лимфоцитов, может оказаться одним из альтернативных путей восстановления иммунной реактивности организма в условиях рассматриваемых вариантов комбинированных радиационно-химических поражений.
Заключение. Установлено, что состояние резистентности к лучевой травме, вызванной γ-облучением, во многом зависит от типа иммунного реагирования. Наиболее чувствительным к этому виду воздействия является Т-звено иммунитета. Угнетение иммунологической реактивности приводит к существенному повышению чувствительности организма к радиационной травме.
Об авторах
А. Е. Антушевич
Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова
Email: vmeda-nio@mil.ru
Россия, Санкт-Петербург
А. Г. Климов
Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет
Email: vmeda-nio@mil.ru
Россия, Санкт-Петербург
А. Н. Гребенюк
Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова
Email: vmeda-nio@mil.ru
Россия, Санкт-Петербург
Б. Л. Гаврилюк
Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова
Email: vmeda-nio@mil.ru
Россия, Санкт-Петербург
А. В. Болехан
Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова
Email: vmeda-nio@mil.ru
Россия, Санкт-Петербург
Е. Г. Богданова
Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова
Email: vmeda-nio@mil.ru
Россия, Санкт-Петербург
В. Я. Апчел
Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова; Российский государственный педагогический университет им. А.И. Герцена
Email: vmeda-nio@mil.ru
Россия, Санкт-Петербург; Санкт-Петербург
Л. Г. Аржавкина
Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова
Email: vmeda-nio@mil.ru
Россия, Санкт-Петербург
А. С. Крючкова
Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова
Автор, ответственный за переписку.
Email: vmeda-nio@mil.ru
Россия, Санкт-Петербург
Список литературы
- Аклеев, А.В. Модификация радиационных иммунных ответов / А.В. Аклеев // Радиационная биология. Радиоэкология. – 2009. – Т. 49, № 5. – С. 517–527.
- Гребенюк, А.Н. Перспективные направления фармакологической коррекции пострадиационных нарушений иммунитета / А.Н. Гребенюк [и др.] // Воен.-мед. журн. – 2006. – Т. 327, № 8. – С. 49–53.
- Гребенюк, А.Н. Основы радиобиологии и радиационной медицины / А.Н. Гребенюк [и др.]. – СПб.: Фолиант, 2012. – 232 с.
- Гуськова, А.К. Актуальные вопросы клинической радиобиологии и пути их экспериментального разрешения / А.К. Гуськова // Радиационная биология. Радиоэкология. – 1997. – Т. 37, вып. 4. – С. 604–611.
- Генес, B.C. Некоторые простые методы кибернетической обработки данных диагностических и физиологических исследований / В.С. Генес. – M.: Наука, 1967. – 203 с.
- Кондратьева, Т.К. Новые экспериментальные модели Т-клеточного и В-клеточного иммунитета / Т.К. Кон - дратьева, Н.В. Михеева, Л.Н. Фонталин // Актуальные вопросы теоретической и прикладной инфекционной иммунологии. Механизмы противоинфекционного иммунитета. – М.: Б. и., 1987. – С. 63–64.
- Легеза, В.И. Комбинированные радиационные поражения и их компоненты / В.И. Легеза, А.Н. Гребенюк, В.В. Бояринцев. – СПб.: Фолиант, 2015. – 216 с.
- Легеза, В.И. Радиобиология, радиационная физиология и медицина: словарь-справочник / В.И. Легеза [и др.] – 3-е изд., испр. и доп. – СПб.: Фолиант, 2017. – 176 с.
- Минаева, Л.В. Экспериментальная оценка роли изменений системы глутатиона в реализации побочных цитотоксических эффектов повторного введения циклофосфана / Л.В. Минаева: дис. … канд. мед. наук. – СПб., 2007. – 178 с.
- Неменова, Ю.М. Методы лабораторных клинических исследований / Ю.М. Неменова. – M.: Медицина, 1972. – 424 с.
- Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств / А.Н. Миронов [и др.]. – Ч. 1. – М.: Гриф и К, 2013. – 944 с.
- Юнкеров, В.И., Математико-статистическая обработка данных медицинских исследований / В.И. Юнкеров, С.Г. Григорьев. – СПб.: ВМедА, 2002. – 266 с.
- Ярилин, А.А. Радиация и иммунитет. Вмешательство ионизирующих излучений в ключевые иммунные процессы / А.А. Ярилин // Радиационная биология. Радиоэкология. – 1999. – Т. 39, № 1. – С. 181–189.
- Neta, R. Modification with cytokines of radiation injury: suggested mechanisms of action / R. Neta // Environ. Health Prospect. – 1997. – Vol. 105, Suppl. 6. – P. 1463–1468.
- Zaalberg, O.В. A simple method for detecting single antibody-forming cells / O.В. Zaalberg // Nature. – 1964. – № 202. – P. 1231–1236.
Дополнительные файлы
