Влияние аминокислотного спектра пептидных органопрепаратов на эффективность фармакотерапии

Полный текст

Введение. В клинической практике специалистов отечественного здравоохранения и Содружества Независимых Государств в последние 20 лет при терапии актуальной неврологической, офтальмологической, педиатрической, нейрохирургической и других видов патологии стали активно применяться отечественные лекарственные препараты пептидной структуры – кортексин, ретиналамин и пинеамин (последние 2 года). Эти препараты в конце прошлого столетия были разработаны специалистами Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова, а внедрены в практику здравоохранения исследователями и сотрудниками группы компаний «ГЕРОФАРМ» (Санкт-Петербург).

Большой положительный опыт применения пептидных препаратов [8, 12] подтвердил свойства, характерные для этой группы лекарств:
– адресность и органотропность;
– высокая эффективность при минимальных дозировках и курсах;
– совместимость со всеми видами препаратов и терапии;
– оптимальная фармакокинетика;
– отсутствие побочных эффектов в процессе лечения.
Создатели пептидных препаратов установили и другие характеристики. Так, на примере кортексина было найдено, что его пептиды состоят из 15 и более L-аминокислот, имеют более 15 различных микрои макроэлементов, витаминную группу (тиамин, рибофлавин, ниацин, α-токоферол и ретинил) [14].
Понятно, что состав лекарственного препарата определяет его фармакокинетику и терапевтический эффект. Этот постулат подтверждается и «Инструкцией по применению…», где, например, сказано «Сложный состав церебролизина, активные фракции которого состоят из сбалансированной и стабильной смеси биологически активных олигопептидов, обладающих суммарным полифункциональным действием, не позволяет провести обычный фармакокинетический анализ отдельных компонентов» [9].
С учётом вышеизложенного и того факта, что аминокислоты определяют большинство терапевтических характеристик пептидных препаратов, возникла необходимость точного, адресного изучения аминокислотного состава кортексина, ретиналамина и пинеамина. Были взяты несколько серий препаратов, выпущенных в период 2012–2014 гг. При этом для более адекватной оценки результатов исследования кортексина препаратом сравнения выбран известный многие десятилетия препарат пептидной структуры церебролизин фирмы «ЭВЕР Нейро Фарма ГмбХ» (Австрия).

Цель исследования. Разработать методику анализа свободных и связанных аминокислот в белках и пептидах, определить их качественный и количественный состав в современных известных органопрепаратах, используемых в лечении пациентов.

Материалы и методы. Первым этапом работы явилась необходимость разработки отдельных методик анализа для определения свободных и связанных аминокислот в форме белков и пептидов. «Связанные аминокислоты» – это общее количество свободных аминокислот и аминокислот, определяемых после гидролиза пептидных связей в белках и пептидах.

Методика исследования состояла из двух этапов: оптимизация условий подготовки проб к анализу и поиск условий хроматографического разделения, что требовало максимальной унификации разрабатываемых методик с целью упрощения проведения анализа. Максимальной унификации удалось достичь в сфере хроматографического разделения. Так, в случае определения свободных и связанных аминокислот условия хроматографического анализа были абсолютно идентичны и предполагали разделение в режиме обращенно-фазовой ультраэффективной жидкостной хроматографии (ОФ УЭЖХ) как одного из самых современных вариантов хроматографического процесса.
Особенности методики определения свободных и связанных аминокислот отличались лишь условиями подготовки проб. Для свободных аминокислот подготовка проб заключалась в приготовлении раствора органопрепарата в 0,1 М соляной кислоте с концентрацией около 4 мг/мл и в последующем проведении предколоночной дериватизации аминокислот. В случае определения связанных аминокислот пробоподготовка включала в себя стадию кислотного гидролиза белков и пептидов, входящих в состав органопрепарата. После гидролиза пробы нейтрализовывали и осуществляли предколоночную дериватизацию.
Исключение составляли анализы (пробы) связанного триптофана, так как при кислотном гидролизе происходит почти полное разрушение триптофана, поэтому для его определения проводится щелочной гидролиз насыщенным раствором гидроксида бария [13]. Определяя триптофан, не требуется проводить предколоночной дериватизации, поскольку в состав молекулы входит хромофорная ароматическая функциональная группа. Количественный анализ триптофана проводился по оригинальной разработанной методике.
Хроматографическая часть методик анализа и условия предколоночной дериватизации разработаны и проведены на основании материалов приложения «UPLC Amino Acid Analysis Solution (System Guide – 71500129702/Revision B, Waters)». Все анализы выполнены с использованием жидкостного хроматографа «Waters Acquity UPLC», оборудованного спектрофотометрическим диодно-матричным детектором (свидетельство о проверке № 242/4441-2015 от 01.07.2015 г.), и хроматографической колонки AccQ•Tag Ultra Colum, 2,1×100 мм, диаметр сорбента 1,7 мкм фирмы «Waters» (Соединенные Штаты Америки).
Применялись все известные материалы и реактивы, а для сравнения – стандартный образец: раствор стандартного образца аминокислот фирмы «Waters» (part # WAT088122) и триптофана (Sigma-Aldrich, кат. №. Т0254).
Исследование предусматривало приготовление подвижных фаз и растворов, подготовку проб и градуировочных растворов для анализа. Приготовленные испытуемые растворы конкретных органопрепаратов и градуировочные растворы подвергались хроматографическому анализу в специальных оптимизированных условиях.
Внутрилабораторную валидацию методов определения содержания свободных и связанных аминокислот в органопрепаратах проводили согласно рекомендациям ICH Validation Of Analytical Procedures: Text And Methodology Q2 (R1) (Complementary Guideline on Methodology dated 6 November 1996, incorporated in November 2005) по наиболее критическим с точки зрения аналитического контроля показателям «Специфичность», «Линейность» и «Правильность». В качестве модельной системы, с использованием которой выполнена валидация, выбран образец кортексина, лиофилизат (серия 11112).
Для доказательства специфичности методик количественного определения свободных и связанных (кроме триптофана) аминокислот необходимо было,чтобы на хроматограммах бланк-раствора отсутствовали хроматогафические пики в области выхода пиков дериватов аминокислот, на хроматограмме испытуемого раствора обнаруживались пики, соответствующие по времени удерживания пикам соответствующих дериватов аминокислот на хроматограмме стандартного раствора, а также требование, чтобы относительное стандартное отклонение (RSD, %), рассчитанное по времени удерживания пиков дериватов аминокислот, для всех измерений не превышало 2% (рисунок).

Рис. Хроматограммы исследованного раствора кортексина лиофилизата, серия 11112 (а) при определении связанных аминокислот и раствора церебролизина для инъекций, серия РВ4468 (б)

Обязательным шагом являлась оценка показателя линейности методики количественного определения свободных и связанных аминокислот, что доказывает наличие линейной зависимости площадей хроматографических пиков дериватов аминокислот от их концентрации в градуировочных растворах. С учетом уравнения линейной регрессии для каждой аминокислоты и коэффициента корреляции от 0,99953 до 0,99990 диапазон линейности для каждой аминокислоты не превышал в среднем 0,05 мкг/мл.
При оценке правильности методик определения аминокислот была подтверждена близость (сходимость) получаемых результатов определения концентрации аминокислот к истинному значению. Для этого хроматографическому анализу подвергали образец кортексина, лиофилизат (серия 11112) с известной добавкой аминокислоты глицин и тот же самый образец, но уже без добавки глицина. Такой же подход использован в исследовании при анализе и других пептидных препаратов, выпускаемых ГК «ГЕРОФАРМ».
Правильность (R, %) рассчитывали по формуле:
    
$R=\frac{{\chi }_{найдено}}{{\mu }_{введено}}\times 100\%$,

где ${\chi }_{найдено}$ – концентрация добавки стандартного раствора аминокислот, полученная в процессе анализа, мкг/мл; ${\mu }_{введено}$ – теоретическое значение концентрации добавки стандартного раствора аминокислот, мкг/мл.
В результате расчётов установлено, что правильность полученных результатов находится в пределах от 89 до 107,8%.
Качественный анализ аминокислотного состава, то есть идентификация аминокислот в органопрепаратах, проводился путем сопоставления времени удерживания хроматографических пиков аминокислот в испытуемых и стандартных образцах. Получен список идентифицированных аминокислот с указанием их времени удерживания, также выявлено, что в линейке исследуемых органопрепаратов содержатся непротеиногенные, заменимые L-аминокислоты – орнитин (в кортексине и пинеамине) и таурин (в пинеамине и ретиналамине).
Количественный анализ исследованных протеиногенных L-аминокислот проведен способом абсолютной градуировки с использованием индивидуальных для каждой аминокислоты градуировочных зависимостей. Результат количественного определения представлен в виде содержания аминокислоты (мкг) в 1 мг органопрепарата.

Концентрацию аминокислот определяли по формуле:

$C=\frac{{С}_{град}\times V_{обр}\times F}{a_{обр}}$,

где С – концентрация аминокислот, мкг/мл; $a_{обр}$ – навеска органопрепарата, мг; ${С}_{град}$ – концентрация аминокислоты, полученная по градуировочной зависимости, мкг/мл; $V_{обр}$ – объем раствора образца органопрепарата, мл; F – коэффициент разбавления образца (в случае определения свободных аминокислот F=1).
Статистическая обработка полученных результатов выполнена согласно требованиям Государственной фармакопии Российской Федерации [2]. Полученные результаты изучения аминокислотного спектра пептидных препаратов являются пилотными и пионерскими.

Результаты и их обсуждение. Установлены следующие неизвестные факты:

1. В пределах одного конкретного пептидного препарата спектр аминокислот остаётся стабилен и не изменяется от серии к серии и сроков хранения.
   2. Кортексин, ретиналамин, пинеамин и церебролизин имеют по 17 протеиногенных аминокислот. В пинеамине обнаружены две непротеиногенные заменимые аминокислоты – таурин и орнитин, в ретиналамине – также таурин, в кортексине – орнитин, в церебролизине отсутствует свободная аминокислота цистин (табл. 1–3).
   

    

   Таблица 1

   Общее количество связанных и свободных аминокислот в кортексине и церебролизине, мкг/мг

   Аминокислота	Кортексин, лиофилизат	Церебролизин, раствор для инъекций
   Аминокислота	11112*	10110	230216	250216	Среднее значение	РВ4464	РВ4468	РВ7520	Среднее значение
   His	19,7	21,8	19,2	20,8	20,38	6,88	7,24	8,26	7,46
   Ser	33,2	39,7	33,6	35,3	35,45	3,51	3,64	4,23	3,79
   Arg	53,6	61,7	52,5	54,7	55,63	4,31	4,58	5,13	4,67
   Gly	32,4	42,9	33,3	33,7	35,58	9,27	9,89	11,34	10,17
   Asp	131,6	131,4	120,2	127,5	127,68	17,3	18,8	22,6	19,57
   Glu	187,4	199,2	195	197,6	194,8	26,7	28,9	34,5	30,03
   Thr	21,8	27,5	22,8	23,9	24	3,75	4,01	4,67	4,14
   Ala	35,3	43	36,8	37,3	38,1	15,1	16	19	16,7
   Pro	25,9	35,8	27,1	28,5	29,33	11,7	12,2	14,2	12,7
   Lys	62,9	77,9	61,2	65,1	66,78	28,4	29,2	35,5	31,03
   Tyr	15,9	19,8	16,6	16,8	17,28	2,4	2,61	2,97	2,66
   Met	8,19	9,61	8,35	5,1	7,81	1,61	1,78	2,15	1,85
   Val	27,4	32,6	29,5	29,1	29,65	11,8	11,8	14,6	12,73
   Ile	16,8	21,3	17,5	18,1	18,43	10,4	10,4	12,8	11,2
   Leu	31,7	40,2	34	33,5	34,85	29,1	29,1	35,8	31,33
   Phe	18	21,7	19,1	19,1	19,48	9,94	10,55	12,17	10,89
   Trp	1,87	2,55	2,3	2,05	2,19	2,05	2,17	2,4	2,21
   Taurin	–	–	–	–	–	–	–	–	–
   Ornitin	1,77	3,22	1,24	1,52	1,51	–	–	–	–
   Cумма	725,3	831,7	730,3	749,5	759,2	194,1	203	242,3	213,13

   Примечание: * – здесь и в табл. 2 цифры серий исследованных препаратов.

    

   Таблица 2

   Общее количество связанных и свободных аминокислот в пинеамине и ретиналамине, мкг/мг

   Аминокислота	Пинеамин, лиофилизат	Ретиналамин, лиофилизат
   Аминокислота	10314*	20514	30514	Среднее значение	10513
   His	16,9	16,2	16,4	16,5	14,1
   Ser	33,1	33,6	35,4	34,03	28,8
   Arg	53,6	51	53	52,53	35,7
   Gly	38,1	37,7	38,8	38,20	27,5
   Asp	86	78,3	83,8	82,7	69,2
   Glu	171,1	161,6	172	168,23	112,6
   Thr	28,2	28,2	30	28,8	24,3
   Ala	39,7	38,7	41,5	39,97	33,6
   Pro	31,8	32,5	33,5	32,6	31,3
   Lys	67,5	65,8	70,1	67,8	51,7
   Tyr	18,1	17,5	18,1	17,9	17,1
   Met	8,29	8,81	5,41	8,55	3,1
   Val	36	35,4	37,5	36,3	31,1
   Ile	21,9	38,5	22,8	22,35	18,1
   Leu	38,6	21,6	40,4	39,5	40,8
   Phe	18	18,4	19	18,47	19,5
   Trp	1,69	2,13	2,42	2,08	1,11
   Taurin	9,15	7,27	7,37	7,93	4,1
   Ornitin	18,7	20,6	16,1	18,47	–
   Cумма	736,5	713,7	743,5	731,23	563,7

    

    

   Таблица 3

   Содержание свободных аминокислот в исследованных органопрепаратах, мкг/мг

   Аминокислота	Кортексин, лиофилизат	Церебролизин, раствор для инъекций	Пинеамин, лиофилизат	Ретиналамин, лиофилизат
   Аминокислота	11112	10110	230216	250216	РВ4464	РВ4468	РВ7520	10314	20514	30514	10513
   His	1,06	1,02	0,75	0,96	5,59	5,47	5,49	1,05	1,14	0,88	0,49
   Asn	3,14	2,72	4,05	3,59	1,04	1,14	1,71	3,21	2,33	2,43	1,11
   Ser	4,36	4,89	3,31	4,07	1,46	1,47	1,43	4,47	4,04	3,94	3,16
   Arg+Gln	22,7	21	24	22,4	3,19	3,19	3,13	14,4	14,7	13.5	6,39
   Gly	4,07	4,61	2,85	4,32	6,83	6,7	6,65	4,89	4,95	4,41	2,71
   Asp	45,7	30,9	24,5	35,3	13,2	13	12,6	12,9	9,94	10,1	8,3
   Glu	78,5	66,5	77,6	82,8	17,7	16,4	16,7	52,7	49,3	50,1	26,9
   Thr	1,84	1,89	1,16	1,54	1,57	1,56	1,55	2,15	1,52	1,75	1,49
   Ala	5,6	5,71	3,98	4,94	12,8	12,6	12,3	6,49	5,16	5,2	3,9
   Pro	0,87	0,89	0,3	0,82	8,95	8,78	8,63	1,29	0,74	0,81	1,04
   Cys	1,55	1,34	1,38	1,84	–	–	–	1,49	1,2	1,23	0,64
   Lys	10,96	11,17	7,29	8,97	25,9	25,4	24,6	9,4	8,92	9,06	5,98
   Tyr	1,1	1,12	0,67	0,57	1,78	1,81	1,79	1,81	1,51	1,41	0,73
   Met	1,15	1,66	0,53	0,7	2,21	2,19	2,18	0,84	0,77	0,75	0,09
   Val	1,85	1,66	1,36	1,48	9,43	9,28	9,17	2,33	1,46	1,68	1,75
   Ile	1,15	1,05	0,98	1,02	8,86	8,69	8,55	1,48	1,16	1,13	0,82
   Leu	3,13	2,53	2,13	2,76	26,8	26,3	25,9	4,44	3,04	3,28	3,12
   Phe	1,81	1,62	0,96	1,33	9,15	9,06	9,06	1,94	1,83	1,76	1,1
   Trp	0,28	0,32	–	0,14	2,22	2,19	2,22	0,31	0,24	0,17	0,83
   Taurin	–	–	–	–	–	–	–	9,72	6,24	6,45	4
   Ornitin	1,8	2,98	1,31	1,41	–	–	–	20,6	19	19,4	–
   Сумма	192,6	165,6	159,1	181	158.9	155,4	153,6	157,8	139,1	139,3	74,6

   
   3. В кортексине по сравнению с церебролизином (в расчёте на 1 мг органопрепарата), при одинаковых величинах триптофана абсолютное количество каждой из остальных 16 аминокислот достоверно большее, в частности аспарагиновой, глутаминовой кислот и тирозина – в 6,5 – 7 раз, серина – в 9 раз, аргинина – в 12 раз.
2. Выявлены различия в аминокислотной структуре препаратов: в кортексине основная доля свободных и связанных аминокислот приходится на глутаминовую (45%) и аспарагиновую (20%) кислоты, а в церебролизине из свободных аминокислот лейцин занимает 17%, лизин – 16%, глутаминовая кислота – 11%, а среди связанных аминокислот аспарагиновая кислота определяется в 3%, глутаминовая кислота – в 1,6%, и полностью отсутствует цистин. Наличие в кортексине непротеиногенной аминокислоты орнитина (табл. 3), являющейся в метаболизме предшественником глютаминовой кислоты, нужно рассматривать как фактор, дополнительно увеличивающий энергетическую составляющую препарата.
   5. Основной свободной аминокислотой пинеамина является глутаминовая кислота (35%) и орнитин (14%), что суммарно (49%) определяет энергетический пул препарата. В аминокислотном составе офтальмонейропротектора ретиналамина общее количество аминокислот значительно меньшее, чем в остальных органопрепаратах, а основную долю составляет также глутаминовая кислота – 20%. Присутствие в ретиналамине таурина подтверждает обоснованность офтальмологического использования препарата, при этом таурин снижает резистентность к инсулину, что в клинической практике подтверждается эффективностью ретиналамина в терапии диабетической офтальмонейропатии.
   Таким образом, факт стабильности пептидных препаратов подтверждает надежность существующей технологии их изготовления, неизменность лечебных свойств и устойчивость всех рассмотренных отечественных пептидных препаратов при соблюдении регламентирующих условий хранения и применения. Тезис о том, что «Сложный состав церебролизина ... не позволяет провести обычный фармакокинетический анализ отдельных компонентов» [9] – не подтверждается.
   Установленные факты различия спектра аминокислот в исследованных пептидных препаратах дают основания для трактовки их фармакокинетики, в частности – наличие в кортексине большого количества глутаминовой (45%) и аспарагиновой (20%) свободных аминокислот, считающихся активными нейромедиаторами [1, 5], может являться объяснением активной положительной динамики неврологического статуса пациентов с 1–2 суток при острых нарушениях мозгового кровообращения (табл. 4). В этой связи известно, что L-глутаминовая и L-аспарагиновая кислоты, составляющие суммарно в кортексине 65% всех аминокислот, активно влияют на функцию головного мозга. Будучи нейромедиаторами, они обеспечивают передачу нервного импульса между нейронами, улучшают когнитивный статус, в целом – оказывают многогранное влияние на обмен веществ. При этом они активируют энергообмен в нейронах (в процессе метаболизма L-глутаминовая кислота превращается в α-кетоглутарат с выделением энергии).

Таблица 4

Сравнительная характеристика свойств и клинической эффективности кортексина и церебролизина

Последнее обстоятельство даёт возможность выстроить всю цепь исследований, проведенных за последнее десятилетие, доказывающих лечебную эффективность кортексина и выявленное основное свойство его фармакокинетики – энергетически сберегающее действие.
Логическая последовательность установленных этапов фармакокинетики:

а) результаты, приведенные выше, прямо указывают на L-глутаминовую, L-аспарагиновую кислоты и орнитин как на основные биоэнергетические «источники» препарата;
б) доказана возможность кортексина восстанавливать содержание аденозинтрифосфата в молодых и старых нейронах [6];
в) чёткое инструментально и наглядно продемонстрированное влияние кортексина на модулирование электрического потенциала нейронов [11];
г) доказанный в клинических условиях с помощью функциональной магнитно-резонансной томографии факт энергетически сберегающего действия кортексина у пациентов, страдающих хроническими нарушениями мозгового кровообращения [7], что также в обобщенном виде [3] подтверждается ранее опубликованными результатами.

Заключение. Впервые установлены конкретные цифровые значения аминокислотного спектра пептидных препаратов, имеющие не только теоретическое, но и важное практическое значение. Выбор церебролизина в качестве препарата сравнения с кортексином объясняется тем, что другого близкого по показаниям и структуре препарата просто нет, хотя по степени готовности церебролизин – это гидролизат, то есть конечный продукт технологического процесса, являющегося важным этапом его изготовления. В то же время пептидные препараты отечественного производства – кортексин, ретиналамин и пинеамин, имеющие двухкомпонентный состав – оригинальную пептидную субстанцию и стабилизатор (аминокислота глицин), реально переносят процесс гидролиза на метаболизм пациента. Многолетний опыт применения кортексина не выявил изменения обмена веществ при его внутримышечном введении, что объясняется минимальным количеством препарата (10 мг), постоянным наличием и доступностью аминопептидаз, кратковременностью действия препарата (через час после его введения электрогенез головного мозга возвращается к исходным значениям [10]). Последнее обстоятельство, на примере низкодозированного нейропротектора кортексина, доказывает и определяет необходимость более частых ежедневных инъекций пептидных препаратов, увеличения длительности и частоты курсов лечения.

Таким образом, можно считать, что определилось точное фармакокинетическое название «Кортексин низкодозированный» – препарат пептидной структуры, обладающий биоэнергетической направленностью по оптимизации метаболизма нейронов.

Об авторах

А. О. Руденко

Email: Mark.Dyakonov@geropharm.com
Россия, г. Санкт-Петербург

Т. Э. Елтышева

Email: Mark.Dyakonov@geropharm.com
Россия, г. Санкт-Петербург

М. М. Дьяконов

Автор, ответственный за переписку.
Email: Mark.Dyakonov@geropharm.com
Россия, г. Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы

Доп. файлы

Действие

1. JATS XML

Скачать

2. Рис. Хроматограммы исследованного раствора кортексина лиофилизата, серия 11112 (а) при определении связанных аминокислот и раствора церебролизина для инъекций, серия РВ4468 (б)

Скачать (165KB)

Метаданные