Совершенствование контроля качества воды с использованием мембранных технологий и специфических методов детекции

Полный текст

Введение. Одной из важнейших задач стоящих перед санитарной микробиологией, является разработка и совершенствование микробиологических методик исследования объектов внешней среды. Исследования, связанные с экологией и здоровьем населения, важны в связи с возрастающими рисками биологического загрязнения объектов среды.

Вода является одним из факторов передачи возбудителей кишечных инфекций бактериальной, вирусной и паразитарной этиологии. По данным Роспотребнадзора, в 2010 г. в Российской Федерации было зарегистрировано 44 вспышки водного характера с числом пострадавших 2095 человек [2]; в 2013 г. в России по сравнению с 2012 г. отмечался рост заболеваемости вирусным гепатитом А – на 5,7%, брюшным тифом – в 2,5 раза, а также энтеровирусными инфекциями – в 3,3 раза, в том числе энтеровирусным менингитом – в 3,4 раза. В 2014 г. в структуре инфекционной заболеваемости острые кишечные инфекции занимали рейтинговые позиции и составили 548,9 на 100 тыс. населения; в 2015 г. отмечен рост острых кишечных вирусных инфекций, при этом доминировала ротавирусная инфекция (84,5%) [3, 4, 6, 9].
Достоверность и эффективность санитарно-микробиологических исследований напрямую зависит от пробоподготовки [10]. Среди различных методик пробоподготовки методика мембранной фильтрации воды рассматривается как один из унифицированных и перспективных для концентрирования контаминантов воды бактериальной и вирусной природы [1, 9, 14]. Для концентрирования бактерий и вирусов в санитарных исследованиях в основном используются пористые фильтрующие мембраны (ФМ) в виде дисков. Среди огромного количества постоянно синтезируемых материалов, используемых для изготовления фильтрующих мембран, только несколько гидрофильных синтетических органических полимеров используются в целях санитарного контроля качества воды. На сегодняшний день для концентрирования бактерий из воды на российском рынке представлены мембраны из следующих материалов: ацетата целлюлозы, нитрата целлюлозы, регенерированной целлюлозы, полиамида, смеси эфиров целлюлозы и др. [8].
Приоритетность использования фильтрующих мембран в России связана с историей развития мембранных технологий. Первое производство мембранных фильтров было начато в 1922 г. в Германии из нитрата целлюлозы. Затем с 1927 г. организовано первое в мире коммерческое изготовление при участии разработчика мембранных фильтров австрийского, немецкого химика Зигмонди Рихарда Адольфа, лауреата Нобелевской премии по химии в 1925 г., «За установление гетерогенной природы коллоидных растворов и за разработанные в этой связи методы, имеющие фундаментальное значение в современной коллоидной химии». Отечественное производство мембранных фильтров из ацетата целлюлозы было изначально предназначено для сгущения фитопланктона, и начато в 1931–1932 гг. экспериментальной фабрикой ультрафильтров Министерства коммунального хозяйства Российской Советской Федеративной Социалистической Республики (г. Мытищи). С этого времени в России широко используются фильтрующие мембраны из ацетата целлюлозы. Так, для подсчета Escherichia coli (E.coli) в 1932 г. специалистами Рублевской водопроводной станции Москвы были внедрены в практику мембранные фильтры [7].
C появлением высокомолекулярного соединения полиамида в 60-е г. XX в. модификации полиамида с различными коммерческими названиями широко используются в мембранной фильтрации («капрон», «ПА-6», «ПА-66» и др.) [5]. Полиамидные мембраны нашли широкое применение для концентрирования вирусов из воды [9, 12]. В последнее время изучаются свойства положительно заряженных ФМ для концентрирования вирусов [14, 16].
Различные механизмы фильтрации водных проб через пористые ФМ определяют выбор режима фильтрации. Ситовой механизм применим для извлечения бактерий, когда частицы задерживаются порами мембран, меньшими по размеру, чем бактерии. Средний диаметр пор для извлечения бактерий более 100 нм, что соответствует микрофильтрационным технологиям. При размерах вирусов менее 100 нм, ситовой механизм реализуется в режиме ультрафильтрации [12].
Однако экспериментальная оценка мембран для ультрафильтрации, в том числе и амидо-имидных мембран, показала, что методика ультрафильтрации обладает высокой эффективностью при концентрировании вирусов из воды, но не позволяет проводить фильтрование больших объемов воды (10 л и больше) из-за быстрого забивания пор [9]. Опыт применения различных пористых микрофильтрационных мембран показал их эффективность в отношении удержания вирусов из водных проб [9, 16]. Установлено, что механизм сорбции вирусов на фильтрующих мембранах с размером пор 0,2 мкм (больше размера вирусных частиц) обусловлен слабыми взаимодействиями типа вандерваальсовых сил, гидрофобных взаимодействий и водородных связей; электростатическими силами. Поскольку вирусы при нейтральных рН заряжены отрицательно, то они адсорбируются на положительно заряженных фильтрующих мембранах, несущих в нейтральной области рН положительный заряд [15]. При этом ультрафильтрационные мембраны успешно применяются при концентрировании микроорганизмов в тангенциальном потоке [8].

Цель исследования. Оценить эффективность фильтрующих мембран, используемых для пробоподготовки и детекции проб воды, по санитарно-микробиологическим и санитарно-вирусологическим показателям качества, нормируемым регламентирующими документами.
Материалы и методы. В экспериментальных исследованиях изучали эффективность фильтрующих мембран в виде дисков в отношении концентрирования бактерий и вирусов из воды в режиме микрофильтрации. Предварительная подготовка ФМ проводилась согласно рекомендациям, перечисленным в паспорте производителя. Для концентрирования и выделения бактерий и вирусов из воды использовали аппараты для мембранной фильтрации воды: прибор вакуумного фильтрования «ПВФ-35» и аппарат напорной фильтрации «АФ-142».
Для извлечения бактерий исследовались ФМ из различных материалов со средним диаметром пор 0,45 и 0,2 мкм на основе ацетата целлюлозы (ФМАЦ-0,2, ФМАЦ-0,45); нитрата целлюлозы (ФМНЦ-0,2, ФМНЦ-0,45); смеси эфиров целлюлозы (ФМСЭ-0,45); полиамида (ФМПА-0,2). Детекцию бактерий проводили с использованием бактериологического посева способом мембранной фильтрации. Модельные водоемы с внесенной суточной культурой E. coli М17-02 в объеме 100 мл пропускали через устройства для фильтрации воды. Фильтрующий материал переносили на чашки Петри со средой Эндо и инкубировали в течение (21+3) ч при 37 Со. Определяли общее количество колоний E. coli, а также количество типичных колоний, выросших на фильтре, в сравнении с прямым посевом, согласно методикам, указанным в нормативных документах [13]. Результаты выражали числом колониеобразующих единиц (КОЕ) E. coli. При оценке мембранных фильтров для извлечения бактерий учитывался «процент извлекаемости» (удержания) мембранных фильтров, который в соответствии с нормативной документацией должен быть ≥ 80% [13].
Исследовали эффективность мембран в отношении концентрирования вирусов с размером пор 0,2 мкм из материалов: полиэфирсульфона (ПЭС-0,2), полиамида (ФМПА-0,2), смеси эфиров целлюлозы (ФМСЕ-0,22), капрона с положительным зарядом со средним диаметром пор 0,2 мкм (Капрон+). Разные объемы модельных растворов ротавирусов в концентрации 107 вирионов/ мл в дистиллированной воде пропускались через мембранные фильтры. Затем элюентом двукратно по 10 мл (3% бифэкстракт на трис-буфере, рН 9,1–9,5) проводили механический смыв с поверхности мембраны в течение нескольких минут; рН полученного элюата доводили до 7,0–7,5 1,0 N раствором соляной кислоты [9]. Маркеры ротавирусов в элюатах определяли, используя полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в режиме реального времени, иммуноферментный анализ (ИФА), иммунохроматографический анализ (ИХА) и реакцию агглютинации латекса (РАЛ). Для проведения ПЦР применяли программируемый амплификатор с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени».
Полученные в результате экспериментальных и натурных исследований данные были обработаны статистически с использованием программного обеспечения Microsoft Office 2007.
Результаты и их обсуждение. Наибольшая эффективность сорбции E.coli при бактериологическом посеве методом мембранной фильтрации получена на ФМ (рис. 1).

 

Рис. 1. Среднее количество колоний E.coli, адсорбированных на изученных фильтрационных мембранах, в сравнении с прямым посевом, (КОЕ), n=30

Наибольшая эффективность извлекаемости (удержания) E. coli при бактериологическом посеве способом мембранной фильтрации получена на ФМ из ацетата целлюлозы и нитрата целлюлозы со средним диаметром пор 0,45 мкм. Результаты с наибольшей сорбционной способностью получены при использовании ФМ из полиамида со средним диаметром пор 0,2 мкм, при этом выявлены особенности роста E. coli на полиамидной мембране в виде роста колоний только в R-форме (рис. 2).

 

Рис. 2. Эффективность извлекаемости (удержания) E.coli на фильтрационных мембранах при бактериологическом посеве методом мембранной фильтрации, в сравнении с прямым посевом, n=10

Сорбирующую эффективность микрофильтрационных ФМ в отношении ротавирусов оценивали по результатам детекции маркеров ротавирусов (антигенов и рибонуклеиновой кислоты) в фильтратах. Наибольшая сорбция ротавирусов определена на полиамидных мембранах: ФМПА-0,2 и Капрон+, на которых маркеры ротавирусов в фильтратах определялись способом ПЦР и не определялись ИФА (табл. и рис. 3).

 

Таблица

Результаты определения маркеров ротавирусов в фильтратах воды

Объем проб воды, л	Концентрация ротавирусов /мл	Материал мембран	Методика исследования
Объем проб воды, л	Концентрация ротавирусов /мл	ФМПА-0,2 мкм, n=10	ПЭС-0,2 мкм, n=10	Капрон+, n=10	ФМСЕ-0,22 мкм, n=10	Методика исследования
0,01	107	– / – / +	– / +++ / +	– / – / +	– / + / +	ИХА/ИФА/ПЦР
0,1	106	– / – / +	– / +++ / +	– / – / +	– / + / +	ИХА/ИФА/ПЦР
1,0	105	– / – / +	– / +++ / +	– / – / +	– / + / +	ИХА/ИФА/ПЦР

 

Рис. 3. Графическая характеристика сорбции ротавирусов на исследуемых мембранах при фильтрации 0,01 л контаминированной ротавирусами воды в концентрации не < ${10}^7$/мл, n=10

Эффективность элюции определялась расчетным методом с учетом содержания ротавирусов в элюатах. В результате определения маркеров ротавирусов в элюатах после фильтрации 0,01 л контаминированной ротавирусами воды в концентрации не <${10}^7$/мл с использованием различных методик получены результаты, подтверждающие наибольшую эффективность концентрирования ротавирусов на полиамидных мембранах (полиамидной фильтрующей мембране ФМПА-0,2 и мембране Капрон+), рисунок 4.

 

Рис. 4. Результаты детекции маркеров ротавирусов в элюатах воды после фильтрации, n=10

Таким образом, эффективность сорбции на полиамидных мембранах приблизительно в 20 раз больше по сравнению с фильтрующими мембранами из полиэфирсульфона и смеси эфиров целлюлозы. В то же время эффективность элюции у фильтрующей мембраны из капрона с положительным зарядом на порядок больше, чем у полиамидной мембраны.

Заключение. Результаты проведенных экспериментальных исследований дают основание рекомендовать в практику санитарно-микробиологического контроля качества воды различных водных объектов определенные материалы и конкретный диаметр пор фильтрующих мембран. Для подсчета E. coli бактериологическим посевом на плотной питательной среде методом мембранной фильтрации рекомендуется использовать ФМ из ацетата целлюлозы и нитрата целлюлозы со средним диаметром пор 0,45 мкм.

Максимальное количество ротавирусов извлечено из воды с помощью капроновых (полиамидных) мембран с положительным зарядом. В элюатах маркеры ротавирусов определялись с использованием ПЦР, ИФА и экспресс-методик ИХА, РАЛ. Использование инновационных фильтрующих материалов для пробоподготовки и детекции ротавирусов в воде позволяет получать большую концентрацию ротавирусов, маркеры которых определяются более простыми экспресс-методиками. Это позволяет рассматривать возможность использования всего лабораторного комплекса контроля качества воды в экстремальных ситуациях и в полевых условиях.

Об авторах

Т. А. Змеева

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: vladimal_spb@list.ru
Россия, г. Санкт-Петербург

В. В. Малышев

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Автор, ответственный за переписку.
Email: vladimal_spb@list.ru
Россия, г. Санкт-Петербург

В. Б. Сбойчаков

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: vladimal_spb@list.ru
Россия, г. Санкт-Петербург

В. Я. Апчел

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: vladimal_spb@list.ru
Россия, г. Санкт-Петербург

С. Г. Марданлы

Закрытое акционерное общество «ЭКОлаб»

Email: vladimal_spb@list.ru
Россия, г. Электрогорск, Московская область

Е. Е. Каталевский

Закрытое акционерное общество «ВЛАДИСАРТ»

Email: vladimal_spb@list.ru
Россия, г. Владимир

Список литературы

Дополнительные файлы