Отправить статью по E-mail Профилактическая и лечебная эффективность рекомбинантного флагеллина при остром радиационном поражении
- Авторы: Сапожников Р.Ю.1, Халимов Ю.Ш.1, Легеза В.И.1, Власенко А.Н.1, Драчев И.С.2, Супрунова Е.Б.2, Гребенюк А.Н.3, Симбирцев А.С.4
-
Учреждения:
- Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова
- Государственный научно-исследовательский испытательный институт военной медицины
- Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова
- Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов
- Выпуск: Том 21, № 3 (2019)
- Страницы: 141-144
- Раздел: Экспериментальные исследования
- Статья получена: 26.11.2023
- Статья одобрена: 26.11.2023
- Статья опубликована:
- URL: https://journals.eco-vector.com/1682-7392/article/view/623872
- DOI: https://doi.org/10.17816/brmma623872
- ID: 623872
Цитировать
Полный текст
Аннотация
Изучено влияние профилактического и терапевтического введения рекомбинантного флагеллина на показатели выживаемости белых беспородных мышей – самцов, подвергнутых воздействию сублетальных доз гамма-излучения. Установлено, что противолучевая активность рекомбинантного флагеллина наиболее эффективно проявляется при профилактическом его введении за 15–30 мин до облучения. Однократное внутрибрюшинное введение в дозе 1000 мкг/кг повышает выживаемость мышей, облучённых в дозе 7 Гр, более чем на 50% (р<0,05). Введение дозы, превышающей 1000 мкг/кг, оказывает выраженное токсическое действие, что усугубляет тяжесть течения острого радиационного поражения и значимо увеличивает гибель лабораторных животных. Терапевтическое введение рекомбинантного флагеллина в дозе 2, 20, 200 и 1000 мкг/кг подкожно через 15–30 мин после облучения в дозе 7 Гр оказывает выраженный терапевтический эффект. Выживаемость лабораторных животных после введения этих доз рекомбинантного флагеллина составляет от 39 до 50% в различных группах. Значимых различий между группами при оценке выживаемости и средней продолжительности жизни (СПЖ) не выявлено. Следовательно, с увеличением либо с уменьшением дозы рекомбинантного флагеллина его лечебная эффективность не меняется. При профилактическом введении рекомбинантного флагеллина в дозе 1000 мкг/кг подкожно за 15–30 мин до облучения лабораторных животных в дозе 6,5 Гр количество колониеобразующих единиц в селезенке составляет 20±3. Это почти в четыре раза превышает исследуемый показатель (6±2 колониеобразующие единицы селезенки, абс. ед.) при терапевтическом введении рекомбинантного флагеллина в дозе 20 мкг/кг подкожно через 15–30 мин после облучения в дозе 7 Гр. Полученные результаты подтверждают перспективность проведения дальнейших исследований, направленных на разработку флагеллинсодержащих средств химической защиты от лучевого поражения.
Полный текст
Введение. В настоящее время одной из важнейших и крайне актуальных проблем клинической фармакологии, радиобиологии и медицины в целом остаются вопросы противорадиационной защиты человека. Расширение контактов с источниками ионизирующих излучений в технике и медицине, возможность возникновения аварийных ситуаций на объектах атомной энергетики и ядерных силовых установках — все это определяет необходимость иметь в арсенале современной медицины специальные лекарственные средства, ослабляющие последствия радиационных воздействий [1].
В последнее десятилетие в области радиационной фармакологии значительно возрос интерес к препаратам природного происхождения, одним из которых является белок филаментов бактерий – флагеллин, мощный активатор врождённого и адаптивного иммунитета. Флагеллин является единственным известным естественным лигандом толл-подобных рецепторов 5-го типа (toll-like receptors – TLR-5), локализованных на поверхности многих клеток иммунной системы (дендритных, макрофагов, нейтрофилов, Т-клеток) и разных типов эпителиальных клеток. Агонисты толл-подобных рецепторов в последнее десятилетие привлекают пристальное внимание исследователей, поскольку их действие в эксперименте сопровождается мощным иммуностимулирующим действием, что может быть использовано не только для лечения инфекций, но и в борьбе с онкологическими, аллергическими и другими заболеваниями. Первым агонистом толл-подобных рецепторов, нашедшим применение в клинической практике, стал имиквимод, одобренный для терапии базальноклеточного рака [1, 2].
В остром опыте на лабораторных животных доказано, что рекомбинантный флагеллин, синтезированный отечественными специалистами, проявляет выраженную радиозащитную активность [2]. В Санкт-Петербургском государственном научно-исследовательском институте особо чистых биопрепаратов (Гос. НИИ ОЧБ) разработана технологическая платформа, позволяющая синтезировать высокоочищенные препараты рекомбинантного флагеллина (рФЛ) – как полноразмерного белка, так и его делетированных производных, однако имеются лишь единичные сообщения о его противолучевой активности [2, 4].
Цель исследования. В экспериментах на мелких лабораторных животных изучить противолучевые свойства рФЛ в условиях его профилактического и лечебного применения.
Материалы и методы. Исследование радиозащитного действия рФЛ проводили в опытах in vivo на 120 беспородных мышах – самцах массой тела 20–35 г, полученных из питомника Российской академии медицинских наук «Рапполово» (пос. Рапполово Ленинградской обл.). После поступления из питомника животные в течение 14 сут содержались в карантине, затем были рандомизированы по группам, включающим 12 особей, и до окончания опыта находились в одинако- вых условиях содержания и кормления. Кормление животных проводилось 1 раз в сут в первой половине дня без ограничения доступа к воде. Все манипуляции осуществлялись с соблюдением правил биоэтики при работе с лабораторными животными [3]. Для моделирования острого радиационного поражения (ОРП) лабораторных животных подвергали однократному относительно равномерному гамма-облучению на установке «ИГУР-1». Оценивали течение и исходы ОРП по влиянию на 30-суточную выживаемость и среднюю продолжительность жизни (СПЖ) облучённых мышей. Для оценки механизмов специфической активности рФЛ исследовали экстрамедуллярное кроветворение по методике эндогенного колониеобразования [13]. Определяли количество эндогенных колониеобразующих единиц селезенки (КОЕс) на 9-е стуки после облучения. В работе использовали рФЛ, синтезированный с использованием гена FliC, кодирующего разновидность флагеллина бактерий Salmonella enterica serovar Typhimurium, в Гос. НИИ ОЧБ [2].
Полученные данные подвергали стандартной статистической обработке с вычислением среднего значения показателя и его ошибки. Достоверность различий средних значений показателей выживаемости оценивали с использованием точного метода Фишера, показателей средней продолжительности жизни погибших от облучения животных – по непараметрическому логранк-критерию, количества эндогенных колоний – с помощью U-критерия Манна – Уитни.
Результаты и их обсуждение. Опыты показали, что введение рФЛ улучшает течение и исходы ОРП при введении как до, так и после воздействия ионизирующего излучения. Так, при облучении мышей в дозе 7 Гр выживаемость животных контрольной группы к 30-м суткам составила 21±8%, а величина СПЖ – 14±2 сут. В случае профилактического подкожного введения рФЛ выживаемость облученных мышей в зависимости от введенной дозы увеличивалась на 10–30%, а величина СПЖ – на 1–6 сут (табл. 1).
Таблица 1. Профилактическая эффективность рФЛ при облучении в дозе 7 Гр
Группа | Доза препарата, мкг/кг | Выживаемость, % | СПЖ, сут |
Контрольная | – | 21±8 | 14±2 |
Получавшая рФЛ | 20 | 28±11 | 15±2 |
Получавшая рФЛ | 200 | 33±11 | 16±2 |
Получавшая рФЛ | 1000 | 50±12* | 22±2 |
Примечание: * – различия по сравнению с контрольной группой, р≤0,05.
При этом наблюдалась прямая зависимость радиозащитного эффекта препарата от введенной дозы. Наименее эффективной оказалась доза 20 мкг/кг. При введении рФЛ в такой дозе выживаемость составила 28±11%, а величина СПЖ – 15±2 сут. В случае введения рФЛ в дозе 200 мкг/кг выживаемость облученных мышей увеличивалась до 33±11%, а величина СПЖ – до 16±2 сут. Наилучшее противолучевое действие препарата отмечено при его введении в дозе 1000 мкг/ кг. В этом случае выживаемость мышей составляла 50±12%, а величина СПЖ – 22±2 сут. Выявлено, что с увеличением дозы рФЛ ухудшается его переносимость. Доза препарата, равная 1000 мкг/кг, близка для мышей к субтоксической. Так, если при подкожном введении рФЛ в дозе 2 мкг/кг неблагоприятное действие препарата не проявляется, то его введение в дозе 1000 мкг/кг характеризуется развитием у мышей вялости, заторможенности и снижения реакции на внешние раздражители.
При введении рФЛ после облучения также улучшаются течение и исходы ОРП. В этом случае значение показателя выживаемости увеличивается на 21–30%, а СПЖ – на 4–8 сут в зависимости от дозы препарата. Так, наилучшие результаты отмечены при введении рФЛ в дозе 2 и 20 мкг/кг. При введении препарата в таких дозах выживаемость облучённых мышей составляет 50±12%, а величина СПЖ – 22±3 сут. Увеличение вводимой дозы рФЛ приводит к снижению выживаемости и СПЖ. Так, при введении рФЛ в дозе 200 и 1000 мкг/кг выживаемость составляет 39±11% и 42±14%, а СПЖ – 18±2 сут и 21±2 сут соответственно (табл. 2).
Таблица 2. Терапевтическая эффективность рФЛ при облучении в дозе 7 Гр
Группа | Доза препарата, мкг/кг | Выживаемость, % | СПЖ, сут |
Контрольная | – | 21±8 | 14±2 |
Получавшая рФЛ | 2 | 50±14* | 22±3 |
Получавшая рФЛ | 20 | 50±12* | 21±2 |
Получавшая рФЛ | 200 | 39±11* | 18±2 |
Получавшая рФЛ | 1000 | 42±14* | 21±2 |
Примечание: * – различия по сравнению с контрольной группой, р≤0,05.
Вероятно, такая закономерность связана с токсическими свойствами препарата при его введении в больших дозах.
Для выяснения механизмов специфической активности рФЛ исследовано его влияние на гемопоэз облучённых мышей. Установлено, что к 9-м суткам после облучения масса селезенки мышей, облученных в дозе 6,5 Гр, составила 79±10 мг, при этом на поверхности органа насчитывалось в среднем 5±2 эндогенных колоний. При профилактическом введении рФЛ в дозе 1000 мкг/кг на 9-е сут после облучения зафиксировано количество КОЕс, в 4 раза превышающее показатели контрольной группы – 20±3 КОЕс (табл. 3).
Таблица 3. Влияние рФЛ на показатели экстрамедуллярного кроветворения при облучении мышей в дозе 6,5 Гр
Группа | Доза препарата, мкг/кг | Масса селезенки, мг | Количество КОЕс, абс. ед. |
Контрольная | – | 79±10 | 5±2 |
Профилактического введения рФЛ | 1000 | 84±18 | 20±3* |
Терапевтического введения рФЛ | 20 | 74±10 | 6±2 |
Примечание: * – различия по сравнению с контрольной группой, р≤0,05.
Иная картина наблюдалась при введении рФЛ после облучения: количество эндогенных КОЕс при введении препарата в дозе 20 мкг/кг существенно не отличалось от значения показателя в контрольной группе. Таким образом, в случае профилактического введения рФЛ механизмы действия препарата связаны со стимуляцией кроветворения, а при введении после обучения влияние данного механизма незначительно, что подтверждается работами других авторов [2, 9, 11, 12]. Данные литературы [2, 6, 7, 8] также свидетельствуют о повышении в крови животных после введения флагеллина уровня цитокинов, обладающих гемостимулирующим действием. Тем не менее механизм радиозащитного действия рФЛ может быть более сложным, что требует дополнительного исследования.
Полученные результаты в общем согласуются с данными зарубежных исследователей [6, 11] о высокой противолучевой эффективности рекомбинантного флагеллина. По современным представлениям, фар- макологическая активность флагеллина обусловлена активацией ядерного фактора транскрипции каппа-В (NF-κB), являющегося одним из основных регуляторов экспрессии генов, стимулирующих пролиферацию антиапоптотических белков, белков-антиоксидантов и большого спектра провоспалительных цитокинов, что и предопределяет потенциал флагеллина как биологического протектора от воздействия ионизирующего излучения. Несмотря на то, что активация всех толл-подобных рецепторов происходит по общему сценарию, флагеллин как лиганд TLR-5 с позиции применения в качестве радиопротекторного средства обладает рядом преимуществ. Так, рецепторы TLR-5 интенсивно экспрессируются клетками гемопоэтической системы и эпителия кишечника, являющимися первичными мишенями при радиационном поражении, при этом образование комплекса TLR-5-флагеллин хорошо переносится млекопитающими [9]. Активация NF-κB-сигнального пути при связывании флагеллина рецепторами TLR-5 не приводит к раз- витию «цитокинового шторма», вызванного гиперпродукцией фактора некроза опухолей альфа, как это имеет место в случае лигандов других толл-подобных рецепторов, а способствует стимуляции защитных реакций организма, например, в результате индукции нейтрофилами гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, повышающего выживаемость, пролиферацию и дифференцировку предшественников гранулоцитов, и интерлейкина-6, ускоряющего восстановление костномозгового кроветворения после радиационного воздействия [7, 9].
Также ключевыми механизмами радиозащитной эффективности флагеллина как агониста TLR-5 являются ингибирование радиационно-индуцированного апоптоза и снижение интенсивности свободно-радикальных процессов, обусловленное активацией системы антиоксидантной защиты организма [5, 6, 10, 12]. Таким образом, в основе противолучевого действия флагеллина лежит его способность оказывать влияние на течение основных патологических процессов, приводящих организм к гибели при воздействии летальных доз ионизирующего излучения. Полученные результаты подтверждают данные литературы о перспективности проведения дальнейших исследований, направленных на разработку флагеллинсодержащих средств химической защиты от лучевого поражения.
Выводы
- Рекомбинантный флагеллин оказывает радио- защитное действие при его введении лабораторным животным в дозе 1000 мкг/кг подкожно за 15–30 мин до гамма-облучения в дозе 7 Гр. За 30-суточный пери- од наблюдения рФЛ увеличивает выживаемость 50% лабораторных животных при 80% гибели животных в контрольной группе. Введение флагеллина в дозе, превышающей 1000 мкг/кг, оказывает выраженное токсическое действие.
- Терапевтическое введение рекомбинантного флагеллина в дозе 2, 20, 200, 1000 мкг/кг подкожно через 15–30 мин после облучения в дозе 7 Гр оказывает выраженный терапевтический эффект. Выживаемость лабораторных животных составляет 40–50% при 80% гибели в контрольной группе.
- Профилактическое введение рекомбинантного флагеллина в дозе 1000 мкг/кг подкожно за 15–30 мин до облучения в дозе 6,5 Гр не влияет на массу селезенок мышей. В то же время количество колониеобразующих единиц в селезенке увеличивается в четыре раза по сравнению с контрольной группой. Введение рекомбинантного флагеллина в дозе 20 мкг/кг подкожно через 15–30 мин после облучения в дозе 7 Гр не оказывает влияния на количество КОЕс.
Об авторах
Р. Ю. Сапожников
Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова
Автор, ответственный за переписку.
Email: vmeda-nio@mil.ru
Россия, Санкт-Петербург
Ю. Ш. Халимов
Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова
Email: vmeda-nio@mil.ru
Россия, Санкт-Петербург
В. И. Легеза
Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова
Email: vmeda-nio@mil.ru
Россия, Санкт-Петербург
А. Н. Власенко
Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова
Email: vmeda-nio@mil.ru
Россия, Санкт-Петербург
И. С. Драчев
Государственный научно-исследовательский испытательный институт военной медицины
Email: vmeda-nio@mil.ru
Россия, Санкт-Петербург
Е. Б. Супрунова
Государственный научно-исследовательский испытательный институт военной медицины
Email: vmeda-nio@mil.ru
Россия, Санкт-Петербург
А. Н. Гребенюк
Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова
Email: vmeda-nio@mil.ru
Россия, Санкт-Петербург
А. С. Симбирцев
Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов
Email: vmeda-nio@mil.ru
Россия, Санкт-Петербург
Список литературы
- Аль-Шехадат, Р.И. Получение и изучение свойств рекомбинантного бактериального флагеллина / Р.И. Аль-Шехадат [и др.] // Хим. и биол. безопас. – 2012. – Спец. вып. – С. 109–116.
- Гребенюк, А.Н. Получение различных вариантов рекомбинантного флагеллина и оценка их радиозащитной эффективности / А.Н. Гребенюк [и др.] // Вестн. Росс. воен.-мед. акад. – 2013. – № 3 (43). – С. 75–80.
- Директива 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях. – СПб.: Rus-LASA «НП объединение специалистов по работе с лабораторными животными», рабочая группа по переводам и изданию тематической литературы, 2012. – 48 с.
- Владимиров, В.Г. О некоторых итогах и перспективах развития профилактической радиационной фармакологии / В.Г. Владимиров, И.И. Красильников // Обзоры по клин. фармакол. и лек. терапии. – 2011. – Т. 9, № 1. – С. 44–50.
- Софронов, Г.А. Перспективные направления использования препаратов на основе рекомбинантного флагеллина / Г.А. Софронов [и др.] // Мед. акад. журн. – 2017. – Т. 17, № 2. – С. 7–20.
- Burdelya, L.G. An agonist of toll-like receptor 5 has radioprotective activity in mouse and primate models / L.G. Burdelya [et al.] // Science. – 2008. – Vol. 320, № 5873. – Р. 226–230.
- Carvalho, F.A. TLR5 activation induces secretory interleukin-receptor antagonist (sIL-1Ra) and reduces inflammasome associated tissue damage / F.A. Carvalho [et al.] // Mucosal Immunol. – 2011. – Vol. 4, № 1. – Р. 102–111.
- Chen, H. Activation of Toll-like receptors by intestinal microflora reduces radiation-induced DNA damage in mice / H. Chen [et al.] // Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. – 2014. – Vol. 774. – P. 22–28.
- Honko, A.N., Mizel S.B. Effects of flagellin on innate and adaptive immunity / A.N. Honko, S.B. Mizel // Immunol. Res. – 2005. – Vol. 33, № 1. – Р. 83–101.
- Jones, R.M. Flagellin administration protects gut mucosal tissue from irradiation-induced apoptosis via MKP-7 activity / R.M. Jones [et al.] // Gut. – 2011. – Vol. 60, № 5. – P. 648–657.
- Krivokrysenko, V.I. Identification of granulocyte colonystimulating factor and interleukin-6 as candidate biomarkers of CBLB502 efficacy as a medical radiation countermeasure / V.I. Krivokrysenko [et al.] // J. Pharmacol. Exp. Ther. – 2012. – Vol. 343, № 2. – Р. 497–508.
- Li, W. CBLB502, an agonist of Toll-like receptor 5, has antioxidant and scavenging free radicals activities in vitro / W. Li [et6 al.] // Int. J. Biol. Macromol. – 2016. – Vol. 82. – P. 97–103.
- Till J.E. A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells / J.E. Till, E.A. McCulloch // Rad. Res. 1961. – Vol. 14. –P. 213–222.
Дополнительные файлы
