EFFECTS OF GOLD NANOPARTICLES ON THE PROLIFERATIVE ACTIVITY OF GERM CELLS IN RATS

Full Text

Развитие нанотехнологий, характеризуясь высоким приростом числа новых нанопродуктов, сопровождается существенным отставанием в разработке регламентов безопасности их производства и применения. Одним из наиболее значимых показателей при гигиеническом нормировании тех или иных продуктов является изучение их влияния на репродуктивную функцию, в том числе изучение сперматогенеза у экспериментальных животных. Сперматогенез — это сложный биологический процесс, высокочувствительный к неблагоприятным экологическим факторам. Многие химические вещества оказывают как прямое негативное влияние непосредственно на зрелые половые клетки, так и на клетки-предшественники, находящиеся в стадии пролиферации и дифференцировки. Такие показатели, как масса семенников и количество сперматозоидов в семенной жидкости, широко использующиеся для определения функциональных изменений в семенниках в результате воздействия токсиканта, не дают ответа на вопрос о механизмах репродуктивной токсичности и ее ранних проявлениях. Рутинные гистологические методы также не являются достаточно чувствительными для выявления нарушений сперматогенеза на ранних этапах. Поэтому все чаще в токсикологических исследованиях используют иммуногистохимические методы для выявления изменений в процессах пролиферации и дифференцировки половых клеток при воздействии гонадотоксических веществ с использованием теста на PCNA [9]. PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) — ядерный белок с молекулярной массой 36 кДа, известный также как циклин, выступает в качестве вспомогательного белка к ДНК-полимеразе. Экспрессия PCNA начинает выявляться в ядре делящейся клетки в фазе G1, достигает максимума в фазе S и постепенно снижается к концу фазы G2. Поэтому PCNA считается маркером клеточной пролиферации [7]. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Изучение влияния наночастиц золота на репродуктивную функцию крыс-самцов по стандартной методике [2]. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Наночастицы золота. Наночастицы золота (НЧЗ) диаметром 5 и 20 нм были получены методом цитратно-го восстановления золотохлористоводородной кислоты [1] в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН. Концентрация 5 нм частиц золота составила 7 х 1013 в 1 мл, 20 нм — 8 х 1011 в 1 мл. Определение размеров наночастиц и их концентрации проводили с помощью анализатора размеров частиц ZetaSizer Nano (Malvern Instruments ) и электронного трансмиссионого микроскопа Libra-120 (Carl Zeiss). Экспериментальные животные. Исследование выполнено на 40 беспородных белых крысах массой тела 200—250 г, 20 из которых служили контролем. Животные находились на стандартном лабораторном рационе, со свободным доступом к воде и пище. I опытной группе животных (n = 10) в течение 8 недель вводили внутрижелудочно НЧЗ диаметром 5 нм в количестве 1 мл на животное, II группе (n = 10) — НЧЗ диаметром 20 нм в том же объеме в течение 8 недель. Контрольной группе в аналогичном объеме вводили физиологический раствор в течение 8 недель. Выводили животных из эксперимента декапитацией и производили забор образцов ткани семенников, а также печени и селезенки. Автометаллография. Для определения наночастиц золота в семенниках был использован метод авто Выпуск 2 (42). 2012 47 металлографии (AMG-метод), основанный на принципе увеличения размеров наночастиц с помощью ионов серебра, в результате чего они становятся видимыми в светооптическом микроскопе [4]. В нашей работе был использован AMG-метод в модификации Hacker, так как он характеризуется стабильной воспроизводимостью при больших объемах исследования и не требует соблюдения жестких условий проведения реакции в темноте [5, 6]. Для постановки реакции образцы тканей семенников, печени и селезенки замораживали при -30 оС, получали криостатные срезы толщиной 20 мкм, которые монтировали на стекла, обработанные поли^-лизином, подсушивали и покрывали желатиной для предупреждения неспецифического окрашивания. После этого срезы помещали в раствор, состоящий из 250 мг гидрохинона и 100 мг ацетат серебра, растворенных в 100 мл 1М цитратного буфера (рН = 3,8). Время восстановления определяли экспериментально. В зависимости от толщины срезов экспозиция варьировала в диапазоне 10 — 30 минут. Для прерывания процесса восстановления стекла погружали в 5%-й раствор тиосульфата натрия на 10 минут. Промывали теплой проточной водой, докрашивали 0,1%-м раствором толуидинового синего, обезвоживали, просветляли и заключали в DEPEX. В качестве позитивного контроля использовали препараты печени и селезенки — органов, способных накапливать НЧЗ. При микроскопическом исследовании наночастицы золота определялись в виде мелкодисперсных черных гранул. Иммуногистохимическая реакция на PCNA. Семенники фиксировали в 4%-м растворе параформальдегида на 0,01 М фосфатном буфере (рН = 7,4) 24 часа при 4 оС, обезвоживали и заливали в парафин по стандартной методике. Полученные парафиновые срезы толщиной 5—7 мкм монтировали на стекла, обработанные поли^-лизином («Menzel»). В качестве первичных использовали моноклональные антитела к PCNA («Dako») в разведении 1 : 100. Для восстановления антигенной активности использовали высокотемпературную обработку ткани в миниавтоклаве «Pascal» при Т = 125 °С в течение 3 минут. Постановку иммуногисто-химической реакции проводили с помощью полимерной системы визуализации по стандартному протоколу («Novocastra»). На заключительном этапе реакции срезы докрашивали гематоксилином Майера. В качестве позитивного контроля к PCNA использовали препарат кожи. Негативным контролем служили срезы без инкубации с первичными антителами при полном соблюдении остальных этапов протокола. Темно-коричневый продукт реакции локализовался в ядрах пролиферирующих клеток. Результат реакции оценивали с помощью модифицированного индекса гонадотоксичности [3]. Для этого подсчитывали соотношение радиальных семенных канальцев с PCNA-позитивными сперматогониями и сперматоцитами к их общему количеству, в среднем по 50 канальцев на животное. Результат подсчета выражали в процентах. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием U-критерия Манна-Уитни. Различия считали достоверными при уровне значимости р < 0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ При AMG-исследовании у животных I опытной группы было выявлено диффузное накопление НЧЗ в оболочке семенников, у II группы НЧЗ располагались в виде прослойки внутри оболочки (рис. 1). В паренхиме семенников наночастицы обнаружены не были. В печени наночастицы золота были выявлены в небольших количествах в основном в купфе-ровских клетках. В селезенке следовые количества НЧЗ присутствовали в маргинальной зоне на границе красной и белой пульпы. А Б Рис. 1. Накопление частиц нанозолота (указано стрелкой) в оболочке семенников. А — I группа, Б — II группа. AMG-метод по Hacker. Исходное увеличение х 400 48 Выпуск 2 (42). 2012 Иммуногистохимический анализ показал экспрессию PCNA в ядрах сперматогоний и сперматоцитов ин-тактных животных (рис. 2 А и Б), что соответствует литературным данным [9, 10]. У животных I опытной группы, получавших НЧЗ 5 нм в течение 8 недель, было выявлено снижение на 11 % количества семенных ка нальцев (рис. 3) с высокой активностью PCNA в спер-матогенном эпителии (рис. 2 В и Г). Еще большие изменения наблюдались у крыс II опытной группы, где количество семенных канальцев с PCNA-позитивными сперматоцитами снижалось на 20 % по отношению к контролю (рис. 3). При этом сперматогонии оставались Д Е Рис. 2. Иммуногистохимическая реакция на PCNA в семенниках интактных самцов (А и Б) и в опытных группе (В и Г — НЧЗ диаметром 20 нм, Д и Е — НЧЗ диаметром 5 нм). Ядра иммунопозитивных половых клеток имеют черное окрашивание. Рис. А, В, Д — исходное увеличение х 100; рис. Б, Г, Е — исходное увеличение х 200 Выпуск 2 (42). 2012 49 ЩШПрВЗ [ЩОЙШТЩІ иммунопозитивными, а в сперматоцитах I и I экспрессия PCNA отсутствовала. порядка Рис. 3. Количество семенных канальцев с PCNA-положительными сперматогониями и сперматоцитами (в % %). А — опытная группа I, Б — опытная группа II. Светлые столбики — контроль, темные столбики — опыт ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, при пероральном введении ЧНЗ в семенниках подопытных животных накопление наночастиц размером 5 и 20 нм регистрировали методом автометаллографии только в соединительнотканной оболочке органа, но не в паренхиме. В то же время происходило подавление экспрессии PCNA — фактора пролиферации и дифференцировки клеток на уровне перехода половых клеток от сперматогониев к сперматоцитам I порядка, следствием чего может являться незавершенный сперматогенез. Из представленных данных можно заключить, что по резуль татам автометаллографического исследования НЧЗ размером 5 и 20 нм не могут преодолеть гемато-тес-тикулярный барьер, однако обладают репродуктивной токсичностью.

About the authors

A. Y. Pocheptsov

Email: pochepcov@rihtop.ru

Y. I. Velikorodnaya

B. N. Filatov

References

Supplementary files