MOLECULAR TYPING AND POLYMORPHISM ANALYSIS OF β-LACTAMASE GENES IN PATHOGENIC BURKHOLDERIA SPECIES

Full Text

Характерным биологическим свойством буркхольдерий (Burkholderia cepacia, возбудителя сапа B. mallei и мелиоидоза B. pseudomallei) и близких им микроорганизмов является высокая природная резистентность к широкому спектру антимикробных соединений, что создает значительные трудности для эффективного лечения соответствующих заболеваний [1, 2]. Антибиотики β-лактамного ряда стандартно используются в терапии инфекций, вызванных патогенными бур-кхольдериями. В секвенированных геномах патогенных буркхольдерий первично аннотированы многочисленные последовательности генов β-лактамаз классов А, В и D [7]. Исследование данных детерминант важно как в плане более полного понимания механизмов антибиотикоус-тойчивости буркхольдерий, так и в аспекте совершенствования схем генодиагностики и молекулярно-эпидемиологического мониторинга полирезистентных штаммов. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Разработка технологии молекулярного типирования генов β-лактамаз патогенных буркхольдерий и скрининга мутационных изменений генов β-лактамаз на ос- 98 Выпуск 2 (42). 2012 нове мультипраймерной полимеразной цепной реакции (ПЦР) и анализа плавления ДНК-ампликонов с высоким разрешением. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Дизайн праймеров осуществлен на основе кодирующих последовательностей геномов Burkholderia, гомологичных известным генам β-лактамаз, представленных в общедоступных генетических базах данных. Определение консервативных и вариабельных фрагментов нуклеотидных последовательностей генов β-лакта-маз проведено с использованием процедуры множественного выравнивания по алгоритму ClustalW [9]. Подбор праймеров, комплементарных консервативным фрагментам генов, проведен с использованием программы FastPCR v.6.1.72 (PrimerDigital Ltd.). Предварительная верификация праймеров на геномных сиквенсах бактерий проведена по алгоритму PrimerBLAST (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/ tools/primer-blast). В работе использованы штаммы B. pseudomallei, B. mallei, B. thailandensis, B. cepacia и ряда гетероло-гичных видов микроорганизмов, предоставленные коллекционным центром Волгоградского научно-исследовательского противочумного института. Бактериальные культуры выращивали на Nutrient agar (Difco) в течение 24 — 48 ч при 37 °С. Для выделения геномной ДНК 200 мкл бактериальной суспензии в 0,15 М NaCl pH 7,2 плотностью 2 х 109 мк/мл смешивали с равным объемом лизирующего буфера (20 мМ трис-HCl, 100 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 0,2 мг/мл желатина, 0,9 % Nonidet P-40, 0,9 % Твин 20, 150 мкг/мл протеиназы К), инкубировали при 65 °C 120 мин, прогревали при 96 °C 30 мин для инактивации фермента, центрифугировали (10000 об./мин, 1 мин) и хранили до использования при -20 °С. Для постановки ПЦР и анализа кривых плавления ДНК-фрагментов использовали амплификаторы С1000 и CFX96 («BioRad», США). Программа амплификации для всех пар праймеров состояла из этапов начального прогрева проб при 94 °С 5 мин, 35 реакционных циклов (денатурация 94 °С 30 с, отжиг праймеров 59,9 °С 30 с, удлинение цепи 72 °С 45 с) и финальной элонгации 72 °С в течение 1 мин. Объем реакционной смеси на 1 пробу составлял 25 мкл. В состав ПЦР сме си входили праймеры в конечной концентрации 15 пМ, 1 Ед. DiaTaq ДНК-полимеразы и буфер с дНТФ и MgCl2 (Интерлабсервис, Россия). Анализ кривых плавления фрагментов генов β-лактамаз проводили с использованием реагента SsoFast™ EvaGreen® Supermix («BioRad», США). Плавление проводили в интервале температур 75 — 95 °С с шагом 0,1 °С. Продукты ПЦР анализировали с помощью электрофореза в 1,5 % агарозном геле и визуализировали окрашиванием бромистым этидием. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ На основе анализа девяти первично аннотированных геномов B. рseudomallei, B. mallei и близкородственного непатогенного вида B. thailandensis (Genbank CP000011, CP000545, CP000547, CP000525, CP000572, CP000124, CP000570, BX571965, CP000085), а также 12 неаннотированных геномов данных видов микроорганизмов, представленных в GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) и базе данных J. Craig Venter Institute (http://gsc.jcvi.org/ projects) выбраны 118 кодирующих последовательностей β-лактамаз, формирующих 5 групп гомологии и относящихся к молекулярным классам А (1 группа), В (3 группы) и D (1 группа), к консервативным фрагментам которых были сконструированы 5 пар комплементарных праймеров (табл.). Результаты ПЦР-детекции последовательностей β-лактамаз различных молекулярных классов в препаратах геномной ДНК штаммов возбудителей мелиоидоза и сапа, родственных видов буркхольдерий и гете-рологичных микроорганизмов приведены на рис. 1. Фрагмент гена penA размером 680 п.н. (праймеры bm1F1- bm4R1) обнаружен в геномах всех исследованных штаммов B. pseudomallei, B. mallei, B. thailandensis и B. cepacia. Специфический участок гена металло^-лактамазы класса В (праймеры bm1F2-bm14R2) размером 352 п.н. обнаружен также только у видов буркхольдерий. Фрагмент гена металло^-лакта-мазы класса В (праймеры bps1F3-bps1R3) размером 727 п.н. отмечен только в штаммах B. pseudomallei и B. mallei. Вариант металло^-лактамазы (праймеры bps3F5-bps8R5, размер ампликона 190 п.н.) обнаруживается как у видов буркхольдерий, так и видов отда Праймеры для детекции и типирования генов β-лактамаз патогенных буркхольдерий Праймер Последовательность, 5' — 3' Генетическая мишень Размер ампликона, п.н. bm1F1 bm4R1 TTCCCGCGATCCGCCTGATGA CTTGTTGCCGAGCATCCATGC ß-лактамаза класс А, Genbank CP000547 локус BMA10247 A1040 680 bm1F2 bm14R2 ACGTTCCTCGGC GCGAC GGAAAC CCGGATGATGTTTCGAGTAGCCGTG ß-лактамаза класс В, Genbank CP000011 локус BMA A0168 352 bps1F3 bps1R3 ACGGCAATTCCTCCATTGCGA CTCGTCAGGGTTGCGTCCGGAGT ß-лактамаза класс В, Genbank PRJNA16181 локус BURPS1106B 2313) 727 bps1F4 bps8R4 CGCATTCGTTTTGCTGGGTT GCAT TCTGCAGCGACGAGCCGATCCA ß-лактамаза класс D Genbank PRJNA16181 локус BURPS1106B 2455 440 bps3F5 bps8R5 TCTGTGGCTGCTGCGCGACGAGAT GCACAGCCAGTTCGCGAGT CCGA ß-лактамаза класс В Genbank PRJNA16181 локус BURPS1106B A3704 190 Выпуск 2 (42). 2012 99 ЩШПрВЗ [ЩОЙШТЩІ А В *-• 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 М _ С D Й «■ч n n м m 1 Î } 4 5 * 7 * 9 10 11 12 13 М Штаммы: 1 — B. pseudomallei 56830, 2 — B. pseudomallei 100, 3 — B. pseudomallei 114; 4 — B. pseudomallei 135, 5 — B. pseudomallei 139, 6 — B. pseudomallei C141, 7 — B. thailandensis E264, 8 — B. thailandensis E299, 9 — B. mallei Ц-5, 10 — B. cepacia 25416, 11 — P. aeruginosa 215, 12 — V. cholerae О139 Bengal, 13 — V.cholerae О1 eltor B-139; М — ДНК леддер с шагом 100 п.н. (100 — 1000 п.н.). Рис. 1. Детекция генов β-лактамаз классов А, B и D буркхольдерий в ПЦР с праймерами bm1F1-bm4R1 (A), bm1F2-bm14R2 (B), bps1F3-bps1R3 (C) и bps1F4-bps8R4 (D) ленной гетерологии (V cholerae, P aeruginosa). Ген β-лактамазы класса D (праймеры bps1F4-bps8R4, размер ампликона 440 п.н.) был детектирован в исследуемых штаммах B. pseudomallei и B. thailandensis. Исследование кривых плавления продуктов ПЦР с каждой из пар праймеров проведено с использованием препаратов геномных ДНК 14 коллекционных штаммов B. pseudomallei дикого типа и 5 мутантных штаммов с высоким уровнем резистентности к цефалоспо-ринам III поколения (МПК > 256 мкг/мл). На рис. 2 приведены результаты определения различий в температурах плавления ампликонов, полученных в ПЦР с праймерами bps1F3-bps1R3, специфичными фрагменту гена металло^-лактамазы (класс B). Рис. 2. Температурный сдвиг кривых плавления фрагментов гена металло^-лактамазы (класс B), амплификация с праймерами bps1F3-bps1R3. Wt — исходные штаммы B. pseudomallei, CazR — штаммы B. pseudomallei, резистентные к цефтазидиму Из приведенных данных видно, что резистентные к цефтазидиму штаммы характеризуются сходным сдвигом температуры плавления данного ампликона, что, по-видимому, является результатом однотипных нуклеотидных замен в анализируемой последовательности. По нашему мнению, данный методический подход весьма удобен для предварительного масштабного скрининга кандидатных мутантных последовательностей с целью их дальнейшего секвенирования и определения типа мутационных изменений. Антибиотики β-лактамного ряда, в частности це-фалоспорины и карбапенемы, широко используются в схемах экстренной и пролонгированной терапии мелиоидоза и сапа, однако опыт их применения демонстрирует заметное число случаев развития резистентности возбудителя в ходе лечения [3, 5]. Ранее сообщалось, что возрастание резистентности B. pseudomallei к β-лак-тамам может быть обусловлена как расширением спектра ферментной инактивации, так и снижением чувствительности лактамаз микроба к ингибиторам [4, 10]. В ряде исследований, опубликованных ранее, была разработана методология амплификации, последующего клонирования и функциональной характеристики генов пе-нициллиназы (penA) и оксациллиназы (oxa) возбудителя мелиоидоза [4, 6, 8]. Предложенные авторами олигонуклеотиды фланкировали полную кодирующую последовательность генов и использовались для их клонирования и оценки характера мутационных изменений при формировании резистентности к ампициллину, оксациллину и цефтазидиму. Единого методического подхода для детекции последовательностей β-лактамаз классов А (пенициллина-зы), В (металло^-лактамазы) и D (оксациллиназы, цефа- 100 Выпуск 2 (42). 2012 лоспориназы) у патогенных видов рода Burkholderia до настоящего времени разработано не было. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Результаты, полученные в данной работе, демонстрируют перспективность использования предложенного технологического подхода для исследования распространенности β-лактамаз молекулярных классов А, В и D в геномах штаммов B. pseudomallei, B. mallei и родственных буркхольдерий, разработки систем генетической паспортизации штаммов возбудителей с целью решения практических задач генной диагностики и молекулярного типирования, а также экспресс-детекции возможных мутаций в генах β-лактамаз, приводящих к формированию высокого уровня устойчивости к антибиотикам β-лактамного ряда.

About the authors

I. B. Zakharova

A. V. Romanova

N. N. Teteryatnikova

V. S. Zamaraev

Email: vszamaraev@mail.ru

D. V. Viktorov

References

Supplementary files