WOUND HEALING AND BLOOD FLOW IN RATS WITH DIABETES DURING BLOCKADE OF INDUCIBLE AND CONSTITUTIVE NO-SYNTHASE

Full Text

ЦЕЛЬ РАБОТЫ Изучить влияние NO-системы на показатели микроциркуляции и динамику заживления ран при сахарном диабете. Актуальность вопроса репарации ран в настоящее время несомненна [2]. Данные литературы свидетельствуют о высокой роли NO-системы в патогенезе диабетических ран [6]. Так, оксид азота, образующийся под влиянием конститутивной эндотелиальной NO-синтазы, обладает вазодилатирующими свойствами и снижает повышенную агрегацию тромбоцитов за счет подавления действия вазоконстрикторов (тромбоксана А2, серотонина и др.), то есть действует в качестве ингибирующего фактора, регулирует тромбообразова-ние и адгезию тромбоцитов к поверхности сосудов [10], что способствует улучшению кровоснабжения в ране. Нарушения в работе NO-системы, а также блокада eNOs вызывают снижение показателей микроциркуляции в поврежденной области [3]. Оксид азота, продуцируемый под влиянием iNOs, с одной стороны, действует как специфическая эффекторная молекула, находясь в макрофагах, обеспечивая антимикробный эффект [9]. С другой стороны такой оксид азота, превращаясь в пероксинитрит, участвует в деструкции b-клеток поджелудочной железы, нарушается секреция инсулина, в первую очередь за счет активации транскрипционных факторов (NF-kb), и гиперпродукции свободных радикалов [5]. Блокатор iNOs - аминогуанидин уменьшает тяжесть протекания воспалительной реакции не только при сахарном диабете [4], но и на моделях животных при септичес ком шоке, повышает выживаемость при введении эндотоксинов. Задачей настоящего исследования являлось изучение блокады роли NO-системы в течении репаратив-ных процессов кожных ран при сахарном диабете в условиях раздельной блокады эндотелиальной (eNOs) и индуцибельной (iNOs) синтаз оксида азота. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Исследование было выполнено на 90 крысах-сам-цах Wistar, полученных из питомника лабораторных животных «Столбовая» РАМН, (Московская обл.). Животные содержались в стандартных условиях вивария, согласно правилам GLP при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ З 51000.3-96 и 51000.4-96), Международным рекомендациям по защите позвоночных животных (1997). Животные были разделены на следующие группы: Рана - группа животных с моделированными ранами, которым вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме; Рана + L-NAME, Рана+аминогу-анидин - группы животных с плоскостными ранами, которым вводили L-NAME, аминогуанидин; Рана + СД -группа крыс с экспериментальным сахарным диабетом и моделированными ранами, которым вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме; Рана + СД + L-NAME, Рана + СД + аминогуанидин - группы крыс с экспериментальным сахарным диабетом и моделированными ранами, которым вводили L-NAME, аминогуанидин. Сахарный диабет вызывался введением стрептозотоцина (45 мг/кг, однократно, в/в). Че Выпуск 1 (45). 2013 37 рез 72 ч производили количественное определение глюкозы в крови глюкозооксидазным методом на спектрофотометре (ПЭ-5400В, ЭКРОС). В дальнейшее исследование отбирали животных с уровнем глюкозы крови 12 ммоль/л и выше. После подтверждения развития сахарного диабета моделировались плоскостные раны у наркотизированных животных на предварительно дэпилированной коже спины, в межлопаточной области по специальному трафарету, скальпелем путем иссечения кожи размером 20 х 30 мм [600 мм2 по методике Слуцкого Л. И. (1969)]. В работе были использованы блокатор эндотелиальной NOs: ^нитро^-аргинин метиловый эфир (L-NAME), в дозе 25 мг/кг; блокатор индуцибельной NOs аминогуанидин, в дозе 50 мг/кг, которые вводились в течение 14 дней внутрибрюшинно. Площадь раны измеряли «весовым методом», который заключался в следующем. Заранее на торсионных весах определялся вес 1 см2 кальки. Для измерения площади раны на последнюю накладывали отмытую рентгеновскую пленку и на ее обратной стороне обводили фломастером контуры раны. Полученный рисунок переносили на кальку, а затем вырезали «контур раны» и взвешивали. Полученный вес делили на вес 1 см2 кальки. На 3, 7, 14, 21 сут производили измерение площади раны и вычисляли процент уменьшения величины раны за каждые 7 сут. Уровень кровототока в ране регистрировали с помощью ультразвукового допплерографа, датчика УЗОП-010- 01 (рабочая частота 25 МГ ц, диаметром 0,3 см) и компьютерной программы ММ-Д-КMinimax Doppler v.1.7. (Санкт-Петербург, Россия) в области раневой поверхности [2]. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ После моделирования ран в течение первых трех суток эксперимента наблюдалось быстрое сокращение раневой поверхности, не вследствие репарации, а в большей мере по причине контракции краев раны, и статистически значимых различий между всеми группами в этот обнаружено не было. В последующие дни, в большей степени скорость сокращения ран наблюдалась в группе, получавшей блокатор iNOs - аминогуанидин, затем в группе с ранами, получавшими физиологический раствор, в меньшей степени в группе Рана + L-NAME по сравнению с исходом 3-х сут. (табл.). Анализируя данные, полученные при исследовании групп животных с сахарным диабетом, было выявлено существенное снижение скорости заживления ран. Так, в группе животных с экспериментальным СД, в которой не применялись блокаторы синтеза оксида азота, раневая поверхность сократилась на 89 % на 21-е сутки по сравнению с исходом данной группы. Блокада eNOs с помощью L-NAME приводила к значительному замедлению заживления ран, так практически не наблюдалось сокращения поверхности ран на 7-е сутки (только на 1,89 %), на 21-е сутки площадь сократилась только на 70 %. Более высокая скорость рано-заживления прослеживалась у группы животных с сахарным диабетом, получавшей аминогуанидин, на 14-е сутки площадь ран была на 52 %, а на 21-е сутки - на 86 % меньше, что свидетельствует о том, что блокада iNOs ускоряет заживление ран, а блокада eNOs замедляет этот процесс как у интактных животных, так и у животных с экспериментальным СД (табл.). Можно предположить, что разная скорость заживления в представленных группах обусловлена блокадой eNOs и, соответственно, уменьшением вазодила-тации и ухудшением микроциркуляции в тканях, прилежащих к ране. При проведении доплерографического исследования на животных с ранами были получены данные, Влияние блокады эндотелиальной и индуцибельной NOs на течение заживления ран у животных с ранами на фоне СД и без СД Группы животных Динамика заживления ран, (M ± m), в мм2 и % 3-и сутки 7-е сутки 14-е сутки 21-е сутки Рана 281,07 ± 11,89 220,34 ± 12,20 -21,6 % 98,12 ± 1,10 -65,09 % 18,4 ± 7,8 -93,45 % Рана + Аминогуанидин 280,90 ± 13,56 201,3 ± 13,4 -28,33 % 73,34 ± 12,10 -73,89 % 11,2 ± 6,4 -96,01 % Рана + L-NAME 278,67 ± 6,78 236,23 ± 10,20 -15,22 % 114,23 ± 10,90 -59,0 % 28,70 ± 3,23 -89,7 % Рана + СД 270,7 ± 15,6 240,6 ± 13,2 -11,1 % 150,4 ± 11,1* -44,4 % 53,3 ± 7,9** -80,3 % Рана + СД + Аминогуанидин 301,2 ± 17,8 234,1 ± 3,7 -22,2 % 145,2 ± 12,3* -51,7 % 40,4 ± 6,5** -86,5 % Рана + СД + L-NAME 283,56 ± 13,46 278,2 ± 5,6* -1,89 % 198,2 ± 13,2** -32,2 % 81,6 ± 3,4** -71,2 % Примечание. Рана + СД - группа животных с экспериментальным сахарным диабетом и моделированными ранами на фоне введения блокаторов NO-синтаз; Рана - группа животных с моделированными ранами на фоне введения блокаторов NO-синтаз. *,**Достоверно по отношению к группе Рана, Рана + Аминогуанидин, Рана + L-NAME (P < 0,05); (P < 0,01); достоверность оценивалась с помощью критерия Манна-Уитни. 38 Выпуск 1 (45). 2013 свидетельствующие о влиянии вводимых блокаторов (индуцибельной и конститутивной синтаз) на скорость кровотока в ране. В группе Рана + аминогуанидин скорость кровотока была на 12,5 % выше, а в группе Рана + L-NAME на 13,75 % ниже, чем в группе Рана без применения блокаторов. В группах с сахарным диабетом наблюдалась аналогичная динамика: скорость кровотока в ране была меньше в группе Рана + СД на 56,12 %, в группе Рана + СД + Аминогуанидин на 45,6 %, в группе Рана + СД + L-NAME на 73,76 %, чем скорость кровотока в соответствующих контрольных группах без сахарного диабета (Рана, Рана + аминогуанидин, Рана + L-NAME соответственно) (рис.). Скорость кровотока в ране, Усл.ед Рана + СД - группа животных с экспериментальным сахарным диабетом и моделированными ранами на фоне введения блокаторов NO-синтаз; Рана - группа животных с моделированными ранами на фоне введения блокаторов NO-синтаз. *, **Достоверно по отношению к группе Рана, Рана + Аминогуанидин, Рана + L-NAME (P < 0,05); (P < 0,01); достоверность оценивалась с помощью критерия Манна-Уитни. Рис. Скорость кровотока в ране Полученные нами экспериментальные данные о влиянии NO на скорость локальной микроциркуляции в ране согласуются с данными ряда авторов [7, 8]. Известно, что у больных сахарным диабетом и инсулинорези-стентностью есть нарушения в функционировании NO-системы, соответственно снижена эндотелий-зависимая вазодилатация. По мнению авторов, это может быть обусловлено уменьшением чувствительности эндотелия к инсулину, подавляющим влиянием свободных жирных кислот, свободных радикалов, гликилированных продуктов на активность eNOs [8]. В результате этого при сахарном диабете наблюдается нарушение тканевого кровообращения в участке поражения, ведущее к ацидозу, гипоксии, метаболической интоксикации в ране [1]. Соответственно при блокаде eNOs и снижении синтеза и выделения оксида азота эндотелиального происхождения, ответственного в норме за обеспечение локальной вазодилатации и антитромботического действия, наблю дается снижение уровня кровотока в ране, а также скорости сокращения раневой поверхности, соответственно наблюдается удлинение времени и отрицательная динамика ранозаживления [10]. Полученные нами данные о более высоких показателях локального кровотока в ране, а также скорости сокращения раневой поверхности под влиянием ами-ногуанидина, возможно, связаны с меньшей тяжестью развившегося сахарного диабета, что обусловлено блокадой iNO-синтазы и соответственно блокадой гиперпродукции пероксинитрита, очевидно оказывающего цитотоксическое действие на стенки сосудистого эндотелия и усугубляющего воспалительный процесс в ране. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Полученные экспериментальные данные могут способствовать пониманию роли NO-системы в патогенезе раневого процесса у больных сахарным диабетом. Рассмотренная экспериментальная модель диабетических ран с использованием специфических блокаторов синтаз оксида азота позволяет изучать в дальнейшем на ее основе перспективные соединения, использующиеся для лечения ран при сахарном диабете по механизму модулирующего влияния на NO-систему.

About the authors

A. A. Slietsans

Email: anna_slietsans@list.ru

E. M. Lomkina

I. N. Tyurenkov

References

Supplementary files