DEVELOPMENT OF QUANTITATIVE METHOD OF FLAVONOIDDETERMINATION IN INULA BRITANNICA HERB

Full Text

Девясил британский (Inula britannica L) сем. астровые (Asteraceae) - двулетнее или многолетнее травянистое растение от 15 до 75 см в высоту [7]. Стебель прямостоячий, ребристый, простой или в верхней части ветвистый, в нижней иногда красноватый, густо покрыт прижатыми волосками [9]. Листья ланцетные, эллиптические, острые, цельнокрайние или рассеянно-мелкозубчатые, по краям с короткими шипиками, сверху голые или рассеянно-волосистые, снизу - густо-мелкожелезистые и мягко-шерстистые от прижатых волосков. Нижние листья длинночерешковые, средние и верхние - сидячие, с сердцевидным стеблеобъемлющим основанием [8]. Цветочные корзинки золотисто-желтые, гетерогамные, от средних до крупных (2-5 см в поперечнике), одиночные или собраны по 2-3. Основу корзинки образует общее цветоложе, которое окружено оберткой из видоизмененных верховых листьев. Индивидуальные цветки окружены хохолком из тонких волосков [7]. Ложноязычковые цветки трехзубчатые. Язычки и зубчики трубчатых цветков снаружи густо покрыты золотистыми железками [9]. Плод - голая ребристая семянка цилиндрической формы светло-коричневого цвета с хохолком [6, 7]. В России распространен на юге европейской части, на Северном Кавказе и в Западной Сибири. В Средней России встречается в черноземной полосе [6]. Надземная часть девясила британского содержит 0,008-0,1 % эфирного масла, в состав которого вхо дят сесквитерпены, а также сапонины, алкалоиды, фе-нолкарбоновые кислоты, кумарины (эскулетин, скопо-летин), флавоноиды, тритерпеноиды, стероиды (р-реза-стерол, у-тараксастерол, стигмастерол) [4]. Девясил британский используется в традиционной китайской медицине в форме настоя надземной части или цветков как отхаркивающее средство [9]. В монгольской медицине трава применяется как тонизирующее, общеукрепляющее, повышающее сопротивляемость организма, стимулирующее обмен веществ; листья и соцветия - при перитоните, головной боли, симптомах нарушения мозгового кровообращения, сильном переутомлении. В тибетской медицине надземная часть находит применение при желудочных коликах, злокачественных опухолях; соцветия -при пневмониях, а также в составе сбора - при сухом кашле, подагре, атеросклерозе, ревматизме, тахикардии, нефрите. Сок из свежесобранных растений обладает противокашлевым, местным ранозаживляющим свойствами; экстракт, эфирное масло - антибактериальными свойствами [4]. Однако в нашей стране из-за отсутствия соответствующих нормативных документов девясил британский не является официнальным растением и не используется в достаточной мере, что делает его приоритетным для фармакогностического изучения и включения в число официнальных лекарственных растений. Выпуск 1 (45). 2013 119 Dsempfia Щ1 ЦЕЛЬ РАБОТЫ Разработка методики количественного определения флавоноидов в траве девясила британского (Inula britannica L), произрастающего в Волгоградской области, методом дифференциальной спектрофотометрии и позволяющей проводить оценку качества сырья. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Объектом исследования выступала трава девясила британского, заготовленная в фазу полного цветения (июль-август 2010) от дикорастущих популяций во Фро-ловском районе Волгоградской области. Все использованные в работе реактивы имели степень чистоты ч.д.а. В основу количественного определения флавоноидов в сырье положен метод дифференциальной спек-трофотометрии, основанный на способности флавонои-дов образовывать окрашенные хелатные комплексы со спиртовым раствором алюминия хлорида в среде кислоты хлороводородной разведенной. При этом максимум поглощения первой полосы смещается на 35-50 нм к видимой области по сравнению с исходным флавоноидом и основной максимум поглощения отмечается в диапазоне длин волн 390-410 нм [3]. Для выбора оптимального режима экстрагирования травы девясила британского спиртовые извлечения получали методом экстракции с последовательной сменой этанола 96 %, 70 % и 40 % концентрации и с использованием этанола 70%-й концентрации (как наиболее универсального экстрагента для флавонои-дов). Точную навеску измельченной до размера частиц 1-3 мм травы девясила британского около 1,0 г помещали в колбу со шлифом вместимостью 150 мл, прибавляли 30 мл 96%-го этанола, колбу присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на водяной бане в течение 30 мин. Затем колбу охлаждали под струей воды до комнатной температуры и содержимое фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл. Экстракцию повторяли дважды поочередно 70%-м и 40%-м этанолом. Извлечения фильтровали через тот же фильтр в ту же мерную колбу. Объем фильтрата доводили до метки 96%-м спиртом. Полноту извлечения флавоноидов из сырья подтверждали по отрицательной цианидиновой пробе со шротом [3]. Аналогично получали извлечения с использованием 70%-го этанола [2]. Аликвоты полученных растворов объемом 5 мл помещали в колбы на 25 мл, прибавляли 5 мл 5%-го спиртового раствора алюминия хлорида и 2-3 капли разведенной соляной кислоты. Объем смесей доводили до метки 96%-м или 70%-м спиртом этиловым соответственно и оставляли для прохождения реакции комплексообразования в защищенном от света месте 45 мин. Оптическую плотность продуктов взаимодействия спиртовых извлечений из сырья девясила британского с 5%-м спиртовым раствором алюминия хло рида в среде кислоты хлористоводородной разведенной измеряли на спектрофотометре Solar PV 1251 С при длине волны Xmax = 353 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин вели по формуле: Х = 4 • W • W2 Е1%1см ' m • Va где Ах-оптическая плотность исследуемого раствора; W1, W2 - разведения, мл; Е1 %1см - Государственный стандартный образец (ГСО) лютеолина с алюминия хлоридом при X = 353 нм (400); max v ' ’ m - масса навески исследуемого сырья, г; Va - объем аликвоты, мл [3]. Статистическая обработка результатов химического эксперимента проводилась согласно ОФС 42-0111-09 «Статистическая обработка результатов химического эксперимента» и включала проверку однородности выборки, с последующим вычислением базовых статистических показателей, характеризующих вариационные ряды, с использованием пакета программ Statistica 6.0 (StatSoft, США) и Excel 2000 (MS Office 2000, США). Валидация методики количественного определения флавоноидов в траве девясила британского выполнялась в соответствии с рекомендациями [1] по следующим характеристикам: правильность, прецизионность, специфичность, линейность, аналитическая область (диапазон применения). Поскольку валидируемая методика проводится в легко контролируемых условиях анализа, то не было необходимости определять ее устойчивость. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ В результате проведенных исследований нами было установлено, что максимум оптической плотности ультрафиолетового спектра поглощения продуктов взаимодействия спиртовых извлечений из исследуемых образцов сырья, полученных как методом экстракции с последовательной сменой этанола (96 %, 70 % и 40 %), так и с использованием этанола 70%-й концентрации, с 5%-м спиртовым раствором алюминия хлорида в среде кислоты хлористоводородной разведенной находится Xmax = 353 нм и близок к спектральным характеристикам УФ-спектра раствора государственного стандартного образца лютеолина* - 5, 7, 3', 4'-тетрагидрок-сифлавон. На основании полученных результатов оценку суммарного содержания флавоноидов производили в пересчет на лютеолин и использовали удельный показатель поглощения комплекса раствора ГСО лютеолютеолин имеет максимум поглощения при 360 нм. 120--Выпуск 1 (45). 2013 ©згиирСз [ЩсапГг'ГОМЩ лина с алюминия хлоридом, который, согласно литературным данным, при аналитической длине волны 353 нм равен Е1 %1см = 400,0 [5]. Проверку однородности выборки и идентификацию вариант, отягощенных грубыми ошибками, осуществляли исходя из размаха варьирования. Рассчитанные значения контрольного критерия (Q) не превышали соответствующие табличные ^табл (95 %; 6) с доверительной вероятностью P = 95 %. Следовательно, ни одна из вариант не отягощена грубой ошибкой, то есть выборка считалась однородной и статистические характеристики методики соответственно были признаны достоверными (табл.). Результаты определения суммы флавоноидов в траве девясила британского Содержание флавоноидов в пересчете на лютеолин в извлечениях из травы девясила британского, полученных методом экстракции с последовательной сменой этанола (96 %, 70 % и 40 %), составила (0,94 ± 0,003) %, в извлечениях, полученных с использованием этанола 70%-й концентрации, -(0,83 ± 0,004) %. По результатам метрологического анализа методики установлено, дисперсия результатов количественного определения флавоноидов в сырье девясила британского составляет S2 = 0,002 и S2 = 0,004, что свидетельствует о воспроизводимости результатов анализа. Величина стандартного отклонения (S = 0,005 и S = 0,009) характеризует разброс вариант вокруг среднего и является оценкой соответствующей случайной ошибки, относительная ошибка составляет 0,23 и 0,45 % и не превышает допустимого значения 5 %. Ошибка единичного измерения равна 0,59 и 1,17 % соответственно. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Проанализированы различные методы экстракции травы девясила британского и как наиболее оптимальный для данного вида сырья выбран метод экстракции с последовательной сменой этанола (96 %, 70 % и 40 %), который позволяет наиболее полно извлекать флавоноиды. Предложена методика, которая позволяет определять содержание суммы флавоноидов (в пересчете на лютеолин) в траве девясила британского в присутствии других соединений, она проста в исполнении и не требует дорогостоящей аппаратуры. Полученные данные свидетельствуют, что содержание флавоноидов в траве девясила британского, произрастающего в Волгоградской области, по результатам данной методики составляет (0,94 ± 0,003) %. Проведенная валидационная оценка свидетельствует о ее пригодности для контроля качества исследуемого сырья.

About the authors

A. V. Yanitskaya

I. Yu. Mitrofanova

Email: I.U.Mitrofanova@yandex.ru

References

Supplementary files