LEUKEMIC CELLS CAN COMMUNICATE THROUGH GAP JUNCTIONS

Full Text

Щелевые контакты (ЩК) — основная форма непосредственных межклеточных контактов у млекопитающих [7]. Такие контакты опосредованы взаимодействием коннексиновых каналов. ЩК представлены и в иммунной системе, и играют важную роль в гемопоэзе, презентации антигена, пролиферации и активации лимфоцитов, а также участвуют в формировании сигнальных путей, необходимых для развития воспаления, эк-стравазации клеток, ангиогенеза и метастатических про прямых доказательств гомотипных ЩК между лимфоцитами, хотя для других типов иммунных клеток такие взаимодействия показаны [3] и играют весьма важную функциональную роль, как и гетеротипные ЩК между лимфоцитами и другими типами клеток [5]. При патологических процессах роль ЩК практически не изучена, хотя при лимфопролиферативных процессах вероятность и частота их формирования может быть увеличена за счет расширения пула лимфоцитов и моцессов [6, 8]. До настоящего времени не существовало жет в той или иной мере определять патогенез заболе- 120 Выпуск 2 (46). 2013 ©зшірСз [ЩсоШтІГІМЩ вания путем регуляции обмена малыми молекулами и инициирования слияния клеток. Известно, что ЩК между молекулами стромы и лимфоцитами влияют на чувствительность к химиотерапии [9, 10], а также показана роль коннексин-опосредованного сигналлинга в терапии острых миелобластных лейкозов [4]. Таким образом, роль гомотипных ЩК в патогенезе лимфопролифе-ративных заболеваний не установлена, равно как неизвестно их значение для нормального функционирования клеток. Выяснение значимости гомотипных ЩК в патогенезе лимфом и лейкозов может способствовать развитию нового направления в комбинированной терапии этих заболеваний, что особенно актуально по причине недостаточной эффективности и частого побочного действия существующих видов химиотерапии [1]. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Установить возможность формирования функциональных гомотипных щелевых контактов между клетками Jurkat. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Клеточные культуры. В качестве материала исследования использовались клетки линии Jurkat, клон E6-1, которые культивировались в стандартных условиях в стартовой концентрации 5*105 кл/мл в среде RPMI-1640 (Life Technologies) с добавлением 10%-й сыворотки плода коровы (Sigma), 10 мМ HEPES (Life Technologies), 2 мМ L-глутамина (Life Technologies), 0,1 мМ смеси аминокислот (Life Technologies), 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 5*10-5 М ß-меркаптоэтанола (Fluka) и 2 мМ пирувата натрия (Life Technologies) при 37 °C и 5%-й CO2. Плотность клеток поддерживалась на уровне 106 кл/мл. Жизнеспособность клеток оценивалась перед проведением каждого эксперимента с использованием трипанового синего и составляла не менее 95 %. Мечение клеток. Клетки метились трекерами Vybrant DiI (DiI) и CellTrace Calcein AM (кальцеин) (Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя. Клетки в концентрации 106 кл/мл инкубировались в безсывороточной среде в присутствии DiI (5 мкл/мл клеточной взвеси) в течение 2 мин при 37 °C (для клеток-акцепторов) или присутствии кальцеина (0,4 мкл/мл клеточной взвеси) в течение 40 мин при 37 °C (для клеток-доноров). После этого клетки отмывали трехкратным центрифугированием при 1500 rpm в течение 5 мин в среде RPMI-1640 при при 37 °C. Затем клеточный осадок ресуспендировали в 1 мл полной среды. Для оценки жизнеспособности при проточной цитометрии использовали краситель SYTOX Blue (Life Technologies). Ингибирование щелевых контактов. 1-октанол (Sigma-Aldrich) растворяли в среде RPMI-1640 и добавляли в каждую пробирку со взвесями клеток в концентрации 1 мМ или 10 мкМ. Карбеноксолон (CBX) (Sigma-Aldrich) растворяли в среде RPMI-1640 и добавляли в каждую пробирку со взвесями клеток в концентрации 100 мкМ или 1мкМ. Клетки, предварительно меченые кальцеином и DiI, инкубировали в среде RPMI-1640 в присутствии или в отсутствии ингибиторов при 37 °С и 5%-й CO2 в течение 5 часов. После 5 часов инкубирования донорные и акцепторные клетки смешивали в соотношении 1:1 в 24-луночных планшетах для микроскопии и в пробирках для проточной цитометрии. Визуализация последствий формирования щелевых контактов. Изображения взаимодействующих клеток были получены с использованием системы timelapse микроскопии (Leica). Для этого применяли съемку с интервалом 10 мин в фазово-контрастном режиме и режиме флюоресценции в течение 5 ч после смешивания клеток-доноров и клеток-акцепторов. Проточная цитометрия. Количественный анализ переноса метки производился методом проточной цитометрии спустя 60 и 90 минут после смешивания клеток-доноров и клеток-акцепторов. Оценивалась только жизнеспособная популяция клеток (методом исключения с красителем SYTOX Blue). Измерения производились с использованием цитометра Fortessa и ПО CellQuest (BD Biosciences, США), анализ данных производился с использованием ПО FlowJo (Tree Star, США). Статистический анализ. Все результаты показаны в виде среднего со стандартной ошибкой среднего для пяти и более независимых экспериментов. Значимость различий оценивали с использованием одностороннего ANOVA-анализа. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Для оценки коммуникации между клетками Jurkat мы оценивали степень пассивного переноса трекера между клетками, происходящего через щелевые контакты. В данном случае пассивному переносу подвергается только кальцеин, молекулярная масса которого позволяет ему проникать через каналы, образуемые коннексинами, в то время как DiI является мембранной меткой и не переносится от клетки к клетке (рис. 1), что позволяет исключить перенос, опосредованный простым слиянием клеток. С помощью флуоресцентной микроскопии регистрируется перенос кальцеина, заметный спустя примерно 150 минут после смешивания клеток и продолжающийся в течение примерно 60 минут (рис. 2). Задержка в формировании щелевых контактов может быть объяснена тем фактом, что суспензионным клеткам Jurkat требуется время для формирования монослоя на дне лунки. Пролонгированный контакт клеток в этих условиях удается зарегистрировать с большим трудом. Помимо этого свою роль играет фотовыцветание трекера. Вышеперечисленные факторы затрудняют количественную оценку формирования щелевых контактов. С помощью проточной цитометрии нам удалось произвести количественную оценку переноса кальцеина с максимумом переноса во временной точке 90 мин (рис. 3). После совместной инкубации процент клеток-акцепторов, в которые произошел перенос кальцеина, достигал 39,4 %. Выпуск 2 (46). 2013 121 H@5mpß8 Рис. 1. Экспериментальный подход, используемый в исследовании T=IBO мин Т=170 мин Фазово контрастный режим Флюоресцентный режим (канап 515 нм, капьцеин) Рис. 2. Микрофотографии, демонстрирующие перенос кальцеина. Клетка-акцептор помечена звездочкой на фазово-контрастном изображении и отмечена стрелкой на флюоресцентном изображении 122 Выпуск 2 (46). 2013 ÜOffirrf Рис. 3. Регистрация переноса кальцеина методом проточной цитометрии. Гейтирование выполнено по одиночно позитивным клеткам, меченым DiI либо кальцеином Для подтверждения того, что перенос трекера происходил именно через щелевые каналы, мы использовали контроль с селективными ингибиторами формирования щелевых контактов — 1 -октанолом и CBX. Оба ингибитора подавляли перенос трекера (рис. 4). A CaIceinAM В (1 JiM) (IOjiM) Рис. 4. Гистограмма проточной цитометрии (А), демонстрирующая подавление переноса кальцеина под действием ингибиторов ЩК; относительное подавление переноса кальцеина под действием ингибиторов ЩК, ***p < 0,001 В концентрации 10 мкМ, 1-октанол эффективно подавлял перенос трекера на 30 %. В концентрации 1 мМ подавление переноса также было значительным, но 1-октанол оказывал токсическое действие на клетки Jurkat. CBX подавлял перенос трекера на 16 % в концентрации 1 мкМ, похожие результаты были достигнуты с использованием концентрации 100 мкМ. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Наши результаты демонстрируют, что пролиферирующие клетки лейкоза могут взаимодействовать между собой, что может играть роль в патогенезе лимфопролиферативных заболеваний. Дальнейшие исследования необходимы для определения того, как подобная межклеточная коммуникация может влиять на процессы выживания, пролиферации, хоминга, самообновления клеточных популяций и как на эти процессы можно повлиять применением ингибиторов щелевых контактов. Кроме того, интерес представляют конкретные сигнальные молекулы, которые могут переноситься от клетки к клетке после формирования щелевых контактов, и какие сигнальные пути могут активироваться в ходе таких взаимодействий. Работа поддержана грантами «NIH K99/R00 Pathway to Independence Award (CA157948)», «V ScholarAward from the V Foundation for Cancer Research», NIH R01 (CA154656), Fulbright Faculty Development Program (15121721).

About the authors

P. P. Nesmiyanov

Email: nesmiyanovp@volgmed.ru

A. M. Bogdanova

J. D. Lathia

M. Hitomi

A. Y. Huang

A. V. Strygin

References

Supplementary files