NEUROTOXIC EFFECTS IN THE CENTRAL NERVOUS SYSTEM IN CHRONIC ORGANOPHOSPHORUS INTOXICATION (EXPERIMENTAL STUDY)

Full Text

По современным представлениям, интоксикация фосфорорганическими соединениями (ФОС) приводит к развитию 4 основных синдромов [7]: острого холи-нергического синдрома, интермедиарного синдрома, нейропатии замедленного типа и нейропсихического синдрома. Наиболее известным из них является нейропатия замедленного типа, хотя другие формы также способны вызывать хронические поражения как центральной, так и периферической нервной системы. Первые клинические случаи отдаленной прогрессирующей нейропатии были описаны в литературе около 100 лет назад и относились к отравлениям триорток-резилфосфатом (тритолилфосфатом). В экспериментах наиболее чувствительными к действию триортокрезил-фосфата оказались домашние куры, которые долгие годы были эталонной моделью отдаленной нейротоксичности. Менее чувствительными были лабораторные грызуны (крысы и мыши) и при интоксикации триорток-резилфосфатом локомоторных изменений у них не наблюдали [3]. Более эффективным, с точки зрения моделирования нейротоксичности у грызунов, оказался хлорпирифос. Его введение вызывало различные нарушения поведенческих реакций у крыс и мышей, включая двигательные и когнитивные расстройства [5]. Морфологическим субстратом нейротоксичности, впервые описанным J. B. Cavanagh в 1954 году, является отек аксонов, приводящий к разобщению мембран миелиновых оболочек с образованием вакуолей в дистальных отделах длинных и крупных нервных миелиновых стволов с последующим Валлеровским перерождением поврежденных нервных волокон. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Проявления нейротоксичности, в том числе и в головном мозге, у экспериментальных животных при хронической интоксикации широко применяемым инсектицидом хлорофосом. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ В качестве модельного фосфорорганического соединения был использован 0,0-диметил (1-окси-2,2,2-трихлорэтил) фосфонат, известный под торговой маркой «Хлорофос» (ХФ). При выполнении данной работы был использован ХФ в виде технического продукта (производства ООО «Волгоградпромпроект») с содержанием основного действующего вещества 97,2 %. 10%-й водный раствор ХФ вводили внутри-желудочно. 56 Выпуск 3 (47). 2013 Методом пробит-анализа по Финни была определена ЛД50, которая составила 725 мг/кг (598 ± 844) (при Ttabl = 1,96 S = 1,37). В эксперименте участвовало 20 беспородных половозрелых белых крыс-самцов, весом 150-180 г Крыс содержали в клетках, по 3-4 особи в каждой в помещениях с искусственным освещением (8.00-20.00 ч.-свет, 20.00-8.00 ч. - темнота) при 20-22 оС в условиях свободного доступа к воде и пище. При постановке экспериментов руководствовались требованиями Европейской конвенции по защите экспериментальных животных. Животные были разделены на 2 группы по 10 особей: Контрольная группа, в которой животные получали физиологический раствор. Опытная группа, в которой животные получали ХФ внутрижелудочно в дозе 72,5 мг/кг (1/10 ЛД50) 5 раз в неделю в течение 10 недель с последующим увеличением дозы до 115 мг/кг (1/5 ЛД50) в течение 2 недель. По окончании эксперимента крыс наркотизировали ди-этиловым эфиром и декапитировали. Материалом патоморфологического исследования были образцы головного мозга на уровне - 4,5 мм от Bregma, на уровне мозжечка и продолговатого мозга, а также седалищный нерв на уровне верхней трети бедра. Образцы тканей, предназначенные для патоморфологического и иммуногистохимического исследования, сразу после извлечения помещали в 4%-й раствор параформальдегида (Sigma), приготовленного на 0,01 М фосфатно-солевом буфере с рН = 7,4 (Sigma). Затем образцы заключали в парафиновую среду Histomix по общепринятой методике. Парафиновые срезы толщиной 5 мкм, полученные на ротационном микротоме (MICROM HM340E), монтировали на предметные стекла. Для выявления процессов демиелинизации использовали краситель Luxol fast blue (Acros) для окраски миелиновых волокон с последующей докрас-кой Cresyl violet (Sigma). Миелиновые волокна окрашивались в сине-зеленый цвет, нейроны - от розового до фиолетового. Парафиновые срезы для иммуногистохимическо-го исследования толщиной 4 мкм монтировали на стекла, обработанные поли^-лизином (Menzel). Для детального исследования состояния оболочек аксонов в ЦНС были использованы антитела к основному белку миелина (MBP), (ABCAM, клон BDI221). Изучение тонкого строения нейрофиламентов, как одного из главных компонентов аксонов и тел нейронов, проводили с помощью определения экспрессии белка NF-200 (Novocastra, клон RT97). Для иммуногистохимического исследования состояния системы медиаторного обмена в головном мозге использовали метод определения холинацетил-трансферазы (ХАТ), применялись антитела к ХАТ (Novocastra, клон 38В12). В качестве одного из маркеров медиаторного действия ФОС изучали экспрессию фермента из класса эстераз - параоксаназу 2 (PON2). Применялись антитела к PON2 производства АВСАМ. Для блокирования эндогенной пероксидазы срезы инкубировали 20 минут в 3%-й перекиси водорода. Постановку иммуногистохимических реакций проводили с помощью системы детекции «Dako». Пероксида-зу проявляли 3-3-диаминобензидином из набора протокола. На заключительном этапе реакции срезы докрашивали гематоксилином Майера. Негативным контролем служили препараты без инкубации с первичными антителами при полном соблюдении остальных этапов протокола. Полученные препараты изучали и фотографировали в микроскопе AxioScope A1 (Zeiss), оборудованной цифровой камерой AxioCam MRc5 и обрабатывали в программе ZENpro 2011 (Zeiss). Материалом гистохимического исследования были образцы головного мозга (ГМ) на уровне лобной доли и на уровне - 4,5 мм от Bregma - перекрест зрительного нерва (ПЗН). Образцы тканей, предназначенные для гистохимического исследования, замораживали при температуре -18-20 °С и резали в криостате. Полученные срезы монтировали на одно предметное стекло и инкубировали. В данной работе были использованы следующие методы: определение активности АХЭ и бутирилхолинэстеразы (БХЭ) по методу Кар-новского, а также неспецифических эстераз (НЭ) по методу Пирса [1] Активность гистохимических реакций на препаратах оценивали полуколичественным методом по Соколовскому [2]. Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы Excel- 2010 с использованием /-критерия Стьюдента для средних величин. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ При гистохимическом исследовании изучении головного мозга было отмечено угнетение активности эстераз в неокортексе, подкорковых образованиях и ядрах (табл. 1, рис. 1). При патоморфологическом исследовании головного мозга через 3 месяца после начала эксперимента значимых отличий от контроля обнаружено не было. В периферической нервной системе у экспериментальных животных было выявлено поражение части миелиновых волокон седалищного нерва (рис. 2А, B). Миелиновые оболочки пораженных волокон были истончены или, напротив, увеличены в размерах, а аксоны уменьшены в диаметре. Между аксоном и миели-новой оболочкой образовывались пустоты. Более отчетливо патология миелиновых волокон была заметна при иммуногистохимическом исследовании основного белка миелина (MBP) (рис. 2C, D). Выпуск 3 (47). 2013 57 Таблица 1 Изменение активности эстераз в органах-мишенях при хронической интоксикации ХФ (M ± а) Органы-мишени НЭ АХЭ БХЭ контроль опыт контроль опыт контроль ОПЫТ ГМ на уровне ПЗН 4,00 ± 0,0 3,35 ± 0,244 4,00 ± 0,00 3,46 ± 0,264 4,03 ± 0,09 2,50 ± 0,004 Лобные доли 4,1 ± 0,21 3,18 ± 0,284 4,00 ± 0,00 2,97 ± 0,264 4,00 ± 0,00 3,88 ± 0,13 *р < 0,05. НЭ АХЭ БХЭ Рис. 1. Изменение активности эстераз в головном мозге при хронической интоксикации ХФ. Контроль - Ц Опыт - Q. 1 - головной мозг на уровне перекреста зрительных нервов; 2 - лобные доли А (контроль) C (контроль) D Рис. 2. Поражение миелиновых аксонов седалищного нерва при хронической интоксикации хлорофосом. А (контроль) и В (опыт) - окраска Luxol fast blue. С (контроль) и D (опыт) - антитела к MBP. ПАП-метод, докраска гематоксилином Майера. Scale bar = 200 |jm В 58 Выпуск 3 (47). 2013 ©©(шгГІ^Щ Изучение содержания белка нейрофиламентов в среднем мозге показало снижение экспрессии NF-200 в области Аммонова рога за счет уменьшения количества волокон цитоскелета и их частичной фрагментации (рис. 3А, В). Расстояние, занимаемое истонченными нейрофиламентами, увеличивалось в 2 раза: с 191,5 мкм до 392 мкм. В продолговатом мозге были отмечены признаки дезорганизации нейрофиламентов в проводящих миелиновых волокнах (рис. 3С, D). Они становились более истонченными, рыхлыми, теряя свою упорядоченную структуру. А (контроль) C (контроль) D Рис. 3. Изменение структуры нейрофиламентов в головном мозге при хронической интоксикации хлорофосом: частичная фрагментация в проводящих пучках Аммонова рога (В) и разрыхление в проводящих пучках продолговатого мозга (D). Антитела к NF-200. ПАП-метод, докраска гематоксилином Майера Scale bar = 200 |jm При иммуногистохимическом исследовании ХАТ было выявлено снижение ее активности в проводниковых структурах продолговатого мозга (рис. 4B) по сравнению с контролем (рис. 4A). В то же время в синапсах холинэргических нейронов среднего и продолговатого мозга уровень экспрессии ХАТ оставался неизменным. При исследовании PON2 в продолговатом мозге было отмечено повышение уровня активности исследуемой параоксоназы в нейропиле (рис. 4D). В структурах среднего мозга и в коре больших полушарий изменений в активности PON2 обнаружено не было. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Согласно полученным данным, хроническая интоксикация ХФ сопровождалась умеренно выраженными явлениями демиелинизации в крупных стволах периферических нервов. Проявлениями патологического процесса в нейронах и аксонах головного мозга была деградация одного из компонентов цитоскелета-белка NF-200. Он оказался наиболее чувствительным маркером при токсическом поражении ЦНС. При этом отмечалось повышение активности PON2 в нейропиле продолговатого мозга, что, скорее всего, является адаптационным механизмом нейронов в ответ на стресс-индуцирование [4]. В Выпуск 3 (47). 2013 59 Проводящие миелиновые волокна такими защитными свойствами, по нашим данным, не обладают. В результате проведенного гистохимического исследования было обнаружено устойчивое угнетение активности АХЭ и БХЭ в тканях головного мозга, а наиболее стабильным и глубоким было изменение активности суммы неспецифических эстераз. Параллельно с этим снижалась и активность ХАТ - фермента, катализирующего синтез и ресинтез ацетил-холина в синапсах в проводниковых структурах про- C (контроль) D Рис. 4. Снижение активности ХАТ в проводниковых структурах продолговатого мозга у животных опытной (В) группы по сравнению с контрольной (A). Антитела к ХАТ. ПАП-метод, докраска гематоксилином Майера. Увеличение экспрессии PON2 в нейропиле и на телах нейронов (D) в продолговатом мозге у подопытного животного. Контроль (C). Антитела к PON2. ПАП-метод, докраска гематоксилином Майера. Scale bar = 200 jm долговатого мозга. Оба наблюдения не противоречат друг другу, так как, по-видимому, угнетение процесса синтеза нейромедиатора является следствием дефицита субстратов из-за ингибирования АХЭ молекулами ФОС. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, согласно представленным данным, нейротоксичность, индуцированная малыми дозами хлорофоса в течение длительного периода времени, проявлялась комплексом изменений в головном мозге. На фоне угнетения активности АХЭ, БХЭ и неспецифических эстераз происходила индукция PON2, нарушение процесса ресинтеза аце-тилхолина и деградация опорного белка цитоскеле та нейронов и аксонов NF200. В периферических нервных стволах процесс демиелинизации был выражен значительно меньше и наиболее наглядно проявлялся при иммуногистохимическом определении основного белка миелина.

About the authors

Yu. I. Velikorodnaya

N. I. Mamulaishvili

A. Ya. Pocheptsov

Email: pochepcov@rihtop.ru

References

Supplementary files