STUDY OF POSSIBILITY OF CONJUGATION TRANSFER OF THE PLASMID RTS1 :TN9 FROM ESCHERICHIA COLI TO BURKHOLDERIA THAILANDENSIS AND BURKHOLDERIA CEPACIA STRAINS

Full Text

Представители рода буркхольдерий B. cepacia и B. thailandensis обладают высокой природной резистентностью к антибактериальным препаратам и способны вызывать инфекции у больных с различными иммуно-дефицитными состояниями [1, 7]. Геномы данных видов представлены несколькими хромосомными репли-конами и включают собственные плазмиды и фаги. Это обусловливает, с одной стороны, значительные возможности для адаптации в различных неблагоприятных условиях, с другой - определяет избирательность в восприятии данных элементов при горизонтальном переносе. Ранее была описана конъюгационная передача для плазмид Р1 группы несовместимости (RP4, RP1, R68, RK2, R18) штаммам различных видов буркхольдерий, где были отражены данные о различии в реципи-ентной способности, экспрессии маркеров плазмид и условия их включения в хромосомный репликон [4, 5]. Большая низкокопийная температурочувствительная по репликации и конъюгации плазмида Rts1, обуславливающая резистентность к канамицину, исходно выделенная из клинического изолята Proteus vulgaris, относится к Т-группе. На основании секвени-рования ее геномной последовательности была установлена высокая гомологичность с плазмидами P1 в системе инициации репликации и в структуре модулей [8]. Репликон содержит гены детерминации резистентности к канамицину, шесть различных последовательностей IS элементов и три транспозона, составляющих 28644 п.н., 13 % от ее генома. Кроме того, на плазмиду возможен перенос дополнительных мобильных элементов, определяющих устойчивость к другим антибактериальным препаратам, что делает ее интересной в качестве инструмента для изучения рекомбинационных систем. Множественная антибиотикорезистентность возбудителей инфекционных заболеваний, и в частности буркхольдерий, представляет реальную проблему для эффективной терапии. В связи с этим, исследование горизонтального переноса мобильных генетических элементов (транспозонов, плазмид) является актуальной задачей и способствует раскрытию механизмов формирования лекарственной устойчивости. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Определение возможности конъюгационной передачи плазмиды Rts1::Tn9 от E. coli штаммам B. thailandensis и B. cepacia и изучение особенностей наследования и экспрессии детерминант резистентности. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Штаммы и питательные среды. В работе были использованы штаммы B. thailandensis 295 и B. cepacia АВ 1934 дикого типа, а также штамм E. coli ^ 707 (Rts1 ::Tn9). Для культивирования бактерий использовали L-агар и L-бульон («Difco», США). Определение минимальных подавляющих концентраций (МПК) антибиотиков. МПК офлоксацина (Ofx), ципрофлоксацина (Cip), канамицина (Kan), хлорамфе- Выпуск 4 (48). 2013 55 никола (Cml), полимиксина (Plm) определяли методом серийных разведений на плотных питательных средах. Конъюгация. Бульонные культуры донора E. coli ^ 707 (Rts1 ::Tn9) и реципиентов инкубировали при 28, 32 °С соответственно, в течение 18 ч, конъюгацию проводили согласно методике, описанной ранее [4, 5]. При этом использовали селективную среду с канамици-ном (300 мкг/мл) для отбора рекомбинантных клонов и полимиксином (500 мкг/мл) для контрселекции донора. Об эффективности конъюгационной передачи плазмиды судили по числу выросших рекомбинантных устойчивых к канамицину клонов в пересчете на клетку реципиента. У вариантов, наследовавших плазмиду, определяли уровень приобретенной резистентности к антибиотикам, детерминируемой генами плазмиды и транспо-зона (канамицин, хлорамфеникол) и перекрестной устойчивости к другим препаратам, наличие фенотипа температурочувствительности и стабильности плазмиды Rts1::Tn9 в новом хозяине. Интеграция Tn9 в хромосому. Поскольку плазмида Rts1 ::Tn9 имеет температурочувствительный по репликации фенотип, позволяющий исключать ее из клеток при повышенной температуре [8], штаммы B. thailandensis 295 и B. cepacia АВ 1934, несущие указанную плазмиду, культивировали при 42 оС на среде с хлорамфениколом. Из клонов, выросших в указанных условиях, отбирали варианты, проявлявшие признаки ауксотрофности. В каждом случае анализировали не менее 2000 клонов. Определение вирулентности и цитопатогенности. Вирулентность в B. thailandensis изучали на золотистых хомячках при внутрибрюшинном заражении дозами 1 х106 - 1 х109 м.к. и учитывали динамику гибели в группах. Вирулентные свойства оценивали по LD50, рассчитанной по Керберу. Уровень цитопатогенного эффекта обоих видов определяли, используя растение P. aculeata. На поврежденную скальпелем нижнюю сторону листовой пластинки наносили 0,01 мл микробной взвеси в концентрации 1 х 109 м.к./мл, через 48 ч оценивали цитопатоген-ный эффект по зоне почернения листовой пластинки, мацерации и изъязвления [3]. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Штаммы B. cepacia АВ 1934 и B. thailandensis 295 воспринимали Rts1::Tn9 с частотой 4 х 10-8 на клетку реципиента. Рекомбинантные клоны характеризовались повышенным уровнем устойчивости к канамицину (в 3 раза) и хлорамфениколу (в 6 раз), который практически не отличался от такового E. coliKS 707 (Rts1::Tn9), что указывало на высокую степень фенотипической экспрессии данных детерминант резистентности в новых хозяевах. Кроме того, штаммы, несущие плазмиду, приобретали определенной степени перекрестную устойчивость к другим антибиотикам, в частности к оф-локсацину и ципрофлоксацину (табл. 1). Данная связь зависимой перекрестной резистентности фторхиноло-нов-хлорамфеникола была отмечена нами ранее при получении антибиотикоустойчивых вариантов данных видов буркхольдерий [2]. Таблица 1 Резистентность исходных и генетически измененных штаммов буркхольдерий к антибиотикам Штамм МПК антибиотиков, мкг/мл Ofx Cip Kan Cml B. thailandensis 295 12 5 100 50 B. thailandensis 295 Rts1::Tn9 15 10 300 300 B. cepacia АВ 1934 10 2,5 100 50 B. cepacia АВ 1934 Rts1::Tn9 15 5 300 300 Плазмида сохраняла температурочувствительный фенотип в новых хозяевах, R+ варианты B. cepacia АВ 1934 и B. thailandensis 295 обладали способностью к росту на среде с хлорамфениколом (300 мкг/мл) при 32 оС, но не при 42 оС. При хранении полученных R+ штаммов обоих видов микроорганизмов на питательном агаре без селективного давления антибиотика спонтанной утраты плазмиды не наблюдали. Наследование плазмид, в том числе и буркхоль-дериями, как правило, сопровождается снижением уровня вирулентности [2]. Данная тенденция была отмечена и в наших экспериментах. У мутантов B. cepacia АВ 1934 и B. thailandensis 295, наследовавших плазмиду Rts1::Tn9, наблюдали заметное снижение цитопатогенного эффекта, а у R+ вариантов B. thailandensis 295 - снижение вирулентности (табл. 2). Таблица 2 Вирулентность и цитопатогенность исходных и генетически измененных штаммов буркхольдерий Штаммы LD50 для золотистых хомячков, м. к. Степень цитопатогенного эффекта, P. aculeata B. thailandensis 295 1 X 107 ++ B. thailandensis 295 (Rts1::Tn9) зЬ 0 X + B. cepacia АВ 1934 1 X 10у + B. cepacia АВ 1934 (Rts1::Tn9) не определяли - Культивирование штаммов, несущих плазмиду, при 42 оС дало возможность селекционировать 2 вари- 56 Выпуск 4 (48). 2013 ©згйирСз [ЩсоЩгІГІЩІ анта B. cepacia АВ 1934 и 8 вариантов B. thailandensis 295, которые характеризовались утратой резистентности к канамицину, но сохраняли уровень устойчивости к хлорамфениколу и одновременно приобретали ауксот-рофность, что указывало на интеграцию Tn9 в хромосому. Определение их питательных потребностей по схеме Холлидея показало, что включение транспозона индуцировало мутации зависимости от пролина или глутамина. С течением времени часть Сш^-клонов ре-вертировала к прототрофности, что, вероятно, объясняется перемещением транспозона по хромосоме. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В настоящей работе показана возможность и определены условия передачи в процессе конъюгации плазмиды Rts1::Tn9 от E. coli KS 707 (Rts1::Tn9) штаммам B. cepacia АВ 1934 и B. thailandensis 295 с частотой 6 х 10-8 на клетку реципиента. Получены генетически измененные штаммы с плазмидной антибиотикоустойчиво-стью, детерминанты которой эффективно экспрессируются в новом хозяине, повышая устойчивость штаммов к канамицину и хлорамфениколу в 3-6 раз. Трансконъю-ганты показали снижение уровня вирулентности для золотистых хомячков и цитопатогенности для P. aculeata. Показана возможность интеграции Tn9 в хромосому. Таким образом, можно сделать вывод, о том, что плазмида Rts1::Tn9, также, как и плазмиды Р-1 группы совместимости, может быть использована в генетических исследованиях буркхольдерий.

About the authors

E. V. Molchanova

Email: elenakalinki@yandex.ru

N. P. Ageeva

References

Supplementary files