CHROMATOGRAPHY OF A NEW ADENINE DERIVATIVE WITH ANTIVIRAL ACTIVITY

Full Text

Поиск и внедрение в практику новых биологически активных соединений является одной из актуальных проблем современной медицины. Для ее решения проводится как направленный синтез аналогов существующих биологически активных веществ, так и скрининговые исследования различных групп соединений. Для дальнейшего изучения веществ, продемонстрировавших лучшие показатели, необходима разработка адекватных аналитических методов количественного определения в различном биологическом материале. В настоящее время методом, наиболее полно соответствующим поставленным задачам, является метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) [4]. Соединение VMA-99-82 (адепрофен) является веществом лидером по противовирусной активности, отобранным в результате скриннинговых исследований из целого ряда 9-производных аденина, синтезированных на кафедре фармацевтической и токсикологической химии ВолгГМУ. Данное соединение продемонстрировало высокую ингибиторную активность в отношении различных ДНК- и РНК-содержа-щих вирусов, в частности цитомегаловируса человека и ВИЧ-1 [2, 3, 6]. ЦЕЛЬ РАБОТЫ На примере разработки метода ВЭЖХ количественного определения производного аденина соединения VMA-99-82 будут рассмотрены аналитические проблемы, наиболее характерные при разработке новых хроматографических методов анализа. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Количественное определение проводилось методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе (Shimadzu, Япония) с диодноматричным ультрафиолетовым детектором, длинна волны 205 нм. Хроматографическое разделение осуществлялось на колонке SUPELCOSIL LC-18 (5 мкм; 150 мм х 4,6 мм). Мобильная фаза включала в себя ацетонитрил (УФ 210) (Россия) и буферную систему из 50 мМ р-ра однозамещенного калия фосфата (рН 5,65) в соотношении 40 % : 60 % v/v. Зависимость площадей пиков от концентрации соединения VMA-99-82 анализировалась методом регрессионного анализа. Статистическая обработка результатов проводилась при помощи компьютерной программы Microsoft Excel [1]. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ В результате проведенных исследований было установлено, что соединение VMA-99-82 практически не растворимо в большинстве применяемых в хроматографии растворителей, что поставило дополнительную аналитическую задачу подбора оптимального сольвента. Он должен быть подобран с учетом допустимости введения его в хроматографическую систему, а также обеспечивать степень растворимости, позволяющую использовать раствор соединения VMA-99-82 в качестве абсолютного стандарта. В результате экспериментального подбора в качестве растворителя исследуемой субстанции была выбрана смесь 90%-го этанола и ацетонитрила в соот 94 Выпуск 1 (49). 2014 iSsgiTipfia [Щшгг’РЩІ ношении 50 % : 50 % v/v. В качестве альтернативы, обеспечивающей аналогичную степень растворимости, рассматривался диметилсульфоксид. Итоговым выбором стала смесь этанола и ацетонитрила (50 % : 50 % v/v) из-за большей стойкости при хранении раствора изучаемого соединения и предпочтительности физико-химических свойств для введения в хроматографическую систему. Прочие растворители показывали более низкую степень растворимости соединения VMA-99-82 по сравнению с вышеуказанными сольвентами. При разработке метода извлечения исследуемого соединения из биологического материала необходимо решить две основные задачи: добиться стабильно высокой степени экстракции и максимально очистить пробу. В ходе эксперимента был опробован ряд экстрагентов: 90%-й этанол, ацетонитрил, смесь 90%-го этанола и ацетонитрила, концентрированная соляная кислота, 10%-й раствор трихлоруксусной кислоты (рис. 1). Затем на основании полученных данных была выбрана смесь 90%-го этанола и ацетонитрила (50 % : 50 % v/v), которая обеспечивала высокую степень экстракции соединения VMA-99-82 из биологического материала, стабильность результатов, а также позволяла одновременно с экстракцией провести преципитацию белков плазмы. Рис. 1. Степени экстракции соединения VMA-99-82 из биологического материала различными экстрагентами: A - 90%-й этанол, B - ацетонитрил, C - смесь 90%-го этанола и ацетонитрила, D - концентрированная соляная кислота, E - 10%-й раствор трихлоруксусной кислоты При работе с экстракционной смесью 90%-й этанол : ацетонитрил было установлено, что изменение соотношения ее компонентов, начиная от 10 %, вызывает снижение степени экстракции и потерю воспроизводимости результатов. Четкой зависимости между изменением соотношения компонентов экстракционной смеси и колебанием степени экстракции выявить не удалось из-за значительного разброса результата параллельных измерений. Еще одной трудностью при разработке метода пробоподготовки соединения VMA-99-82 явилось то, что аналит оседал с форменными элементами крови при получении плазмы путем центрифугирования. Эту проблему удалось решить экстрагированием изучаемого соединения непосредственно из цельной крови двойным объемом экстрагента. Итоговый метод извлечения соединения VMA-99-82 из биологического материала выглядит следующим образом. К цельной крови добавляли экстракционную смесь (90%-й этанол : ацетонитрил 50 % : 50 % v/v) в соотношении 1 : 2, затем встряхивали в ультразвуковой ванне (Сапфир, Россия) в течение 15 мин для преципитации белков и центрифугировали 15 мин при 3000 об./мин на центрифуге (Eppendorf, Германия). Полученную надосадочную жидкость вводили в хроматографическую систему. Степень экстракции соединения VMA-99-82 составила не менее 90 %. Далее с использованием подобранных условий пробоподготовки был разработан селективный (рис. 2, 3) и чувствительный метод количественного определения. Рис. 2. Образец хроматограммы стандартного раствора (90%-й этанол : ацетонитрил 50 % : 50 % v/v) соединения VMA-99-82 Рис. 3. Образец хроматограммы соединения VMA-99-82 в биологическом материале Для количественного определения вещества использовали метод абсолютной калибровки. Зависимость площадей пиков от концентрации VMA-99-82 анализировалась методом регрессионного анализа в диапазоне концентраций от 0,5 до 50 мкг/мл. По каждому значению концентрации проводилось 5 параллельных измерений. В результате было установлено, что калиб Выпуск 1 (49). 2014 95 ровочные кривые носят линейный характер, с коэффициентом аппроксимации (R2), равным 1 (рис. 4). R “ 1 s 35 < 25 С : 10 20 30 40 50 60 С, мкг/мл Рис 4. Зависимость площади под хроматографическим пиком от концентрации вещества VMA-99-82 Валидация метода проводилась согласно Guideline on bioanalytical method validation (EMEA 2012) [6]. По полученным результатам измерений были рассчитаны точность и прецизионность (средняя ошибка измерения). Данные представлены в табл. 1. Точность составила в среднем 97,84 %. Прецизионность (средняя ошибка измерения) 5,63 %. Были определены внутридневные процентные колебания (повторяемость метода), которые не превышали 14 % в изучаемых диапазонах концентраций. Междневные процентные колебания (воспроизводимость метода) для изучаемого соединения не превышали в среднем 10 %. Чувствительность метода (предел количественного обнаружения) для изучаемого соединения составляет 1 мкг/мл. Предел обнаружения - 200 нг/мл (табл. 2). При повторном проведении анализа, после 72 ч хранения стандартных растворов соединения при комнатной температуре, средние абсолютные процентные колебания находились в тех же пределах, показывая стабильность исследуемого вещества. При изучении влияния процессов замораживания и таяния было обнаружено, что средние абсолютные процентные колебания для VMA-99-82 находились в тех же пределах, что определяют стабильность вещества под влиянием данных факторов. Таблица 1 Валидационные характеристики метода ВЭЖХ количественного определения соединения VMA-99-82 Номинальная концентрация, мкг/мл Средние результаты измерения, mAU х мин., (M ± m) Средняя ошибка (прецизионность), % Расчетная концентрация, мкг/мл Точность, % 0,5 0,58 ± 0,08 14,42925 1,011814 202,3628 1 0,86 ± 0,09 10,82059 0,933895 93,38954 5 4,54 ± 0,33 7,316464 4,885888 97,71775 25 23,34 ± 0,51 2,203783 25,07974 100,319 50 46,52 ± 1,01 2,175144 49,96805 99,9361 Таблица 2 Основные аналитические параметры метода ВЭЖХ количественного определения соединения VMA-99-82 Параметры Количество Внутридневные колебания (повторяемость), % 14 Междневные колебания (воспроизводимость), % 10 Точность, % 97,84 Чувствительность, мкг/мл 1 Предел обнаружения, нг/мл 200 Средняя ошибка измерения, % 5,63 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, при разработке методов количественного определения малорастворимых веществ в биологических пробах главными аналитическими проблемами являются извлечение из биоматрицы и выбор соответствующего растворителя. Для решения этих проблем необходимо использовать более широкий спектр сольвентов, в том числе нехарактерных для классической обращеннофазной хроматог рафии. Также необходимо учитывать специфику биологического материала. В результате проведенных исследований для количественного определения соединения VMA-99-82 разработан метод высокоэффективной жидкостной хроматографии на обращеннофазной колонке С18 с УФ-детектированием. Способ извлечения подобран оптимально и практически не влияет на среднюю ошибку измере 96 Выпуск 1 (49). 2014 ©зшірСз [ЩсоШтСІМЩ ния хроматографического метода количественного определения. Разработанный метод количественного определения является высокоселективным и высокочувствительным, что позволяет эффективно использовать его для проведения фармакокинетических исследований соединения VMA-99-82.

About the authors

L. A Smirnova

E. A Suchkov

Email: ewgenik@gmail.com

A. F Riabuha

K. A Kuznetsov

A. A Ozerov

References

Supplementary files