CYTOTOXIC EFFECT OF BURKHOLDERIA CEPACIA ON TETRAHYMENA PYRIFORMIS CELLS IN COMMON CULTURE

Full Text

Микроорганизмы комплекса Burkholderia cepacia известны как оппортунистические патогены человека, вызывающие госпитальные инфекции и заболевания у лиц с иммунодефицитными состояниями [9, 10]. Для изучения факторов патогенности этих микроорганизмов обычно используют экспериментальных животных или культуры клеток [7, 8, 13]. Адекватной моделью для оценки вирулентности B. cepacia являются также растения [6]. Показано, что бактерии комплекса B. cepacia могут находиться в симбиотических отношениях с некоторыми представителями простейших (амебами - Acantamoeba spp. и ресничными инфузориями -Tetrahymena pyriformis), в процессе взаимодействия с которыми формируются адаптационные механизмы, необходимые как для сохранения вида во внешней среде, так и для выживания его в эукариотических клетках [2, 5, 11]. В ассоциации с простейшими буркхольдерии длительно существуют в клетках вегетативной формы и остаются жизнеспособными внутри образующихся цист. Известно, что образование цист клетками T. pyriformis происходит при различных неблагоприятных условиях. Вместе с тем, как установлено в недавней работе Pushkareva, et al. (2010), инцистирование этого вида инфузорий может быть результатом цитопатогенно-го действия микроорганизмов, находящихся в ассоциации с ними, и коррелировать с показателями вирулентности бактерий для экспериментальных животных [13]. В настоящей работе мы исследовали влияние бактерий комплекса B. cepacia, культивируемых вместе с T pyriformis, на процесс инцистирования инфузорий. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Определить сохранение жизнеспособности буркхольдерий внутри клеток T pyriformis, сравнить цитотоксический эффект различных штаммов B. cepacia на клетки тетрахимен, а также оценить возможность использования данной модели для дальнейшего изучения бактериальных факторов патогенности. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Аксеническая культура инфузорий T pyriformis получена из Института цитологии РАМН (г. Санкт-Петербург). Тетрахимены выращивали в L бульоне «Difco» (США) при температуре 25 оС. В работе использовали штаммы B. cepacia 25416 (типовой штамм); B. cenocepacia 323, клинический изолят из крови больного; мутантный штамм B. cepacia KM 196, с множественной чувствительностью к антибиотикам, дефектный по белку-порину OpcP1 из коллекционного центра Волгоградского научно-исследовательского противочумного института, а также B. cenocepacia 323С, выделенный из цист T. pyriformis при выполнении данной работы. Для изучения динамики изменения численности микроорганизмов в сокультуре с простейшими бактерии предварительно выращивали на L агаре «Difco» в течение 48 ч при температуре 32 °С, культуру суспендировали в минеральной среде Прескотта для получения взвеси, содержащей 1 х 106 м.к./мл. Культуры простейших и микроорганизмов соединяли в количественном соотношении 1:100 (1 х 104 к/мл : 1 х 106 м.к./мл.) в среде Прескотта и инкубировали при температуре 25 °С от 1, 24 ч до 7, 14 сут. После каждой экспозиции тетрахимены отмывали от внеклеточно расположенных бактерий средой Прескотта путем двухтрехкратного центрифугирования в микроцентрифуге «Eppendorf» (1000 об./мин, 10 мин). Далее клетки простейших разрушали с помощью стеклянных бус, выделяя из них внутриклеточные микроорганизмы. Выпуск 1 (49). 2014 125 ©SSTOpßS ©ôffiïff При определении цитотоксичности штаммов клетки простейших соединяли с культурой микроорганизмов в том же соотношении в L бульоне и инкубировали при температуре 28 °С в течение 1-6 сут. Количество трофозоитов и цист подсчитывали ежедневно в камере Горяева, предварительно обеззараживая сокультуру 10%-м формалином. Морфологические изменения клеток тетрахимен оценивали при световой микроскопии (микроскоп Lomo Micmed 6, увеличение 10 х 90) и визуализировали их на экране компьютера с использованием программы Scope Photo «Hangzhou Scopetek» (Китай). Для выделения инцистированных бактерий сокультуру в L бульоне после перехода всех трофозоитов в цисты оставляли в холодильнике при температуре 8 °С в течение 3 месяцев. После этого разрушали сохранившиеся цисты методом замораживания-оттаивания и выделяли микроорганизмы на селективной среде для B. cepacia, содержащей полимиксин и гентамицин [1]. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Исследование взаимодействия микроорганизмов и тетрахимен в сокультуре в среде Прескотта показало, что поглощение буркхольдерий клетками простейших начинается с первых минут контакта. Клетки тетрахимен при этом изменяют форму и внешнюю структуру, что выявляется при световой микроскопии (их цитоплазма становится более темной, в ней появляются пищеварительные вакуоли). После 1- и 24-часового пребывания в сокультуре количество внеклеточных бактерий, первоначально составлявшее 1 х 106 м.к./мл, снижалось по сравнению с исходной концентрацией в среднем на 1,5-2 порядка. Однако в обоих случаях после разрушения клеток простейших наблюдалось увеличение количества микроорганизмов по сравнению с их содержанием в супернатанте, что свидетельствовало о выделении их из разрушенных тетрахимен (рис. 1). Рис. 1. Динамика изменения концентрации планктонных бактерий B. cenocepacia 323 в сокультуре с тетрахименами: И - исходная концентрация (м.к./мл), К1, К2, - содержание в надосадочной жидкости после 1-2-кратного центрифугирования соответственно, О - концентрация бактерий после разрушения тетрахимен Далее, соединив культуры тетрахимен и буркхольдерий в указанном соотношении, мы увеличили время контакта до 7-14 сут. При этом установили, что после освобождения сокультуры от планктонных бактерий и последующего разрушения тетрахимен также наблюдается увеличение количества выделенных микроорганизмов. Таким образом, исследование взаимодействия B. cepacia с клетками тетрахимен в минеральной среде Прескотта показало, что в сокультуре с ними бурк-хольдерии поглощаются клетками инфузорий в течение первого часа и остаются жизнеспособными внутри них длительное время (7-14 сут.). Для выявления цитотоксического действия B. cepacia на тетрахимены мы инкубировали сокультуры также в соотношении клеток 1 : 100 в бульоне при температуре 28 оС. Микроскопическое исследование установило, что клетки простейших через 1 ч содержали большое количество вакуолей, а в более поздние сроки в сокультуре начинали образовываться цисты в виде клеток округлой формы, покрытых утолщенной оболочкой. Первоначально процесс цистообразования исследовали, используя культуры B. cepacia 25416 и B. cenocepacia 323. За сокультурами наблюдали в течение 6 сут. (рис. 2). Рис. 2. Отношение количества образовавшихся цист к общему количеству клеток T pyriformis в течение 6 суток совместного инкубирования с буркхольдериями, выраженное в процентах: К - количество цист T pyriformis, спонтанно образующихся в бульоне Как видно на рис. 2, динамика цистообразования медленно нарастала независимо от штамма в течение 1-2 сут. и приобретала отчетливые различия, вызванные воздействием этих штаммов, через 3-6 сут. Количественные показатели в соотношении трофозоитов и цист в сокультурах со штаммами 25416 и 323 представлены на рис. 3, который отчетливо демонстрирует более выраженный цитотоксический эффект штамма B. cenocepacia 323. Для дальнейшего исследования цитотоксичности дополнительно были взяты штаммы B. cepacia KM 196 и B. cenocepacia 323С, выделенной из цист T pyriformis. При определении цитотоксичности этих штаммов было установлено, что штамм B. cepacia KM 196 занимает промежуточное положение между «контролем» и исходным штаммом B. cepacia 25416, тогда как B. cenocepacia 323С явно отличается более выраженной цистообразующей активностью как от двух первых штаммов, так и от B. cenocepacia 323 (рис. 4-5). 126 Выпуск 1 (49). 2014 Рис. 3. Соотношение трофозоитов и цист в сокультуре T. pyriformis со штаммами B. cepacia 25416 и B. cenocepacia 323 через 72 ч после начала контакта, p < 0,05 Рис. 4. Соотношение трофозоитов и цист в сокультуре T. pyriformis с различными штаммами B. cepacia через 72 ч после начала контакта, p < 0,05 Рис. 5. Отношение количества образовавшихся цист к общему количеству клеток T. pyriformis через 3 сут. совместного инкубирования с буркхольдериями, выраженное в процентах Последний факт согласуется с известными литературными данными о том, что культуры B. cepacia, как и других микроорганизмов, выделенные из цист простейших, приобретают повышенную инвазивность и вирулентность [2]. Ранее при оценке вирулентности штаммов B. cepacia для экспериментальных животных было установлено, что штамм B. cenocepacia 323, обнаруживший в данном исследовании наибольшую цитотоксичность для тетрахимен, был также более вирулентным для золотистых хомячков, чем B. cepacia 25416 и другие испытанные штаммы [4]. В связи с этим, заслуживает внимания характеристика цитотоксичности мутанта B. cepacia KM 196, производного штамма 25416 с дефектом в функции порообразующего белка OpcP1 и фенотипом множественной чувствительности к антибиотикам [3], который практически не оказывал влияния на инцистирование, что, по-видимому, коррели рует с отсутствием у него вирулентности для золотистых хомячков. Во всяком случае, исследования, проведенные на большой группе мутантных штаммов B. cepacia и родственных ей патогенных буркхольдерий B. pseudomallei и B. mallei с измененной чувствительностью к антибиотикам, показали отчетливое снижение у них вирулентности для экспериментальных животных по сравнению с микроорганизмами дикого типа [4]. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Показано, что микроорганизмы комплекса B. cepacia резистентны к фагоцитирующей активности ресничных инфузорий вида T pyriformis и в сокультуре ними могут сохраняться длительное время (срок наблюдения 14 сут.). Цитотоксическое действие буркхольдерий на клетки тетрахимен проявляется в инцистировании инфузорий. Интенсивность процесса цистообразования находится в зависимости от штамма. При этом наиболее выраженным цистообразующим (цитотоксическим) эффектом обладет штамм B. cenocepacia 323, клинический изолят с повышенной вирулентностью для экспериментальных животных. Цитотоксичность этого штамма увеличивается после пребывания его культуры (3 месяца) в цистах тетрахимен.

About the authors

E. V Korol

Email: vari2@sprint-v.com.ru

L. K Merinova

M. O Nekhezina

E. V Shubnikova

References

Supplementary files