THE IMPACT OF INTRAUTERINE HYPOXIA ON MITOCHONDRIAL HETEROGENEITY WHICH IS CONTROLLED THROUGH ALTERATIONS IN RAT VENTRICULAR MYOCARDIUM

Full Text

Хроническая внутриутробная гипоксия - это наиболее распространенный повреждающий фактор в системе «мать-плод» [7]. Особенности этиопатогенеза и клинические проявления внутриутробной гипоксии плода являются актуальными проблемами в перинатальной медицине и экспериментальной биологии во всех ІШторСз [ЩсміПГКЩ странах мира [1, 9, 12]. Гипоксическое повреждение сердечно-сосудистой системы встречается в 40-70 % случаев [12]. Изменения, возникающие в энергетическом обмене миокарда, приводят к быстрому снижению его сократительной функции, чему способствуют ана-томо-физиологические особенности новорожденного [7]. Известным является факт, что обеспечение энергетических потребностей сердца как одного из наиболее энергозависимых органов определяется функционированием митохондриального аппарата (МА). Во многих исследованиях было показано, что митохондрии функционально и структурно неоднородны. В пределах кар-диомиоцита (Кмц) они различаются как по своей морфологии, так и по биохимическим свойствам [10]. Последние достижения в области методов изучения органелл также показали, что результатами функционального гетерогенитета митохондрий являются особенность окислительно-восстановительного состояния и мембранного потенциала, генерация митохондриальных активных форм кислорода, кальциевый гомеостаз, апоп-тоз и старение клетки. Функционирование МА сократительных Кмц основано на гетерогенности митохондрий, которая предусматривает наличие двух основных режимов работы митохондрий, один из которых представлен высокоэнергетическими органеллами в ортодоксальной и конденсированной конфигурациях, а другой - низкоэнергетическими митохондриями [5]. Важными и до сих пор нерешенными остаются вопросы взаимосвязи неоднородности функции и региональной специализации митохондрий, пути реализации гетерогенитета в клетке и степени их зависимости от патологического состояния [11]. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Определение влияния внутриутробной гипоксии на гетерогенитет митохондрий и пути его реализации в процессе онтогенетического формирования митохондриального аппарата кардиомиоцитов желудочков. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ При проведении экспериментально-морфологического анализа в качестве объекта исследования были использованы белые беспородные крысы-самки и их потомство на разных этапах пренатального и постнаталь-ного онтогенеза. Хроническую пренатальную гипоксию моделировали на беременных самках путем внутрибрю-шинного введения 1%-го нитрита натрия с 10-х по 21-е сутки беременности в дозе 5 мг/100 г веса-дозе, вызывающей гипоксию средней степени тяжести [2]. Контрольным животным вводили внутрибрюшинно 1 мл 0,9%-ного физиологического раствора натрия хлорида. Исследование проведено в соответствии с законодательством Украины (Закон Украины от 15.12.2009 № 1759-VI «О защите животных от жестокого обращения»), правил Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных исследованиях. Дальнейшую обработку полученного материала проводили согласно общепринятым методам световой и электронной микроскопии [6]. Анализ ультраструктур-ных изменений Кмц на этапах постнатального онтогенеза в норме и после воздействия хронической пренатальной гипоксии осуществляли в лаборатории электронной и световой микроскопии кафедры гистологии Днепропетровской медицинской академии с помощью трансмиссионного электронного микроскопа ПЭМ 100-01 («SELMI», Украина) при ускоряющем напряжении 75- 85 кВ и первичных увеличениях от 1500 до 80000. На последующих этапах анализ изображений проводили с помощью специализированного программного обеспечения ImageJ v.1,47. Количественную оценку ультраструктурных изменений проводили путем подсчета доли новообразованных, неизмененных митохондрий, органелл с различной степенью альтерации (обратимо, необратимо поврежденных). Определение достоверности различий между выборками проводили с учетом парного t-критерия Стьюдента, а также непараметрического критерия Уилкоксона в случае отсутствия нормального статистического распределения величин. Полученные результаты обрабатывали с помощью лицензионной программы Statistica 6.1. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Выяснение механизма формирования гетерогенитета МА в онтогенетическом аспекте показало, что митохондрии парануклеарной (ПН), межмиофибриллярной (ММФ) и субсарколеммальной (ССМ) зон клетки функционально и структурно неоднородны, что отражается на реакциях митохондрий, которые развиваются в ги-поксических условиях. Электронно-микроскопический анализ Кмц крыс на 16-е сутки пренатального онтогенеза показал, что в ССМ зоне среди небольших органелл шаровидной или вытянутой формы с прозрачным матриксом определялись набухшие митохондрии с разрушенными кристами и зонами вымывания матрикса. В некоторых из них во внешней митохондриальной мембране наблюдались трещины. При исследовании митохондрий ПН локализации Кмц определялись поврежденные и неизмененные органеллы. Редко встречались митохондрии с умеренным отеком и просветлением матрикса. В ММФ зоне основная популяция органелл была представлена митохондриями относительно крупного размера, удлиненной формы с хорошо развитыми кристами и умеренно плотным матриксом. Анализ митохондрий экспериментальной группы в сравнении с контрольной группой показал, что в этой зоне сократительного Кмц увеличивалась доля органелл, имеющих шаровидную форму, небольшие размеры и площадь внешней митохондриальной мембраны. Важно отметить, что в данных органеллах площадь поверхности внутренней митохондриальной мембраны, количество и плотность крист значительно превышали аналогич 102 Выпуск 4 (52). 2014 ные показатели других митохондрий, которые по ультраструктурному строению соответствуют описанным ранее высокоэнергетическим митохондриям конденсированной конфигурации [5]. В позднем фетальном периоде в условиях гипок-сического воздействия продолжались процессы прогрессирующей альтерации ультраструктуры МА, которые были более выраженными в правом желудочке (ПЖ) по сравнению с левым желудочком (ЛЖ) и в пределах стенки уменьшались в последовательности: субэпикардиаль-ная - интрамуральная-субэндокардиальная зоны [4]. На 20-е сутки в Кмц интрамуральной зоны ПЖ доля необратимо поврежденных митохондрий составляла (26,6 ± 4,9) %, обратимо поврежденных и с признаками перенапряжения - (47,2 ± 6,2) %, новообразованных - (12,9 ± 1,8) %, неизмененных митохондрий - (13,3 ± 2,1) %, что достоверно отличалось от значений нормы. Реакции митохондрий характеризовались умеренной деструкцией и перенапряжением высокоэнергетических орга-нелл преимущественно ССМ локализации, угнетением процессов образования митохондрий в Кмц. Отмечалось увеличение популяции конденсированных форм высокоэнергетических митохондрий в ММФ зоне и уровня ассоциативности в ПН и ММФ зонах клетки, что отражало активную адаптивную реакцию на гипоксию. В митохондриях новорожденных крыс, которые развивались в условиях внутриутробной гипоксии, относительно их внутриклеточной локализации и значения в окислительном обмене определялись ранние и прогрессирующие изменения. Ультраструктурное исследование митохондрий показало, что органеллы ПН локализации были представлены низкоэнергетическими митохондриями небольшого размера со светлым матриксом и неупорядоченными кристами. Встречались митохондрии с признаками перенапряжения: умеренным отеком и участками просветления матрикса, редко - с явлениями разрушения крист. В ССМ зоне органеллы имели шарообразную или удлиненную форму и были представлены субпопуляциями низкоэнергетических и ортодоксальными формами высокоэнергетических митохондрий. Органеллы в основном имели прозрачный матрикс, среди них были значительно набухшие митохондрии, органеллы с разрушенными кристами и зонами резкого просветления матрикса, часто во внешней мембране некоторых из них наблюдались трещины и разрывы. Особенности ультраструктуры митохондрий указывали на напряжение энергетического аппарата в этой зоне, а относительная стабильность в характере ассоциирования органелл компенсировала прогрессивное снижение количества крист в митохондриях, поддерживая достаточный уровень энергии для функционирования АТФ-зависимого трансмембранного транспорта. Митохондрии ММФ локализации были относительно большими, с умеренно развитыми кристами и прозрачным матриксом. Среди таких органелл также была доля митохондрий с явлениями отека и вакуолизации, элементами кристолизиса и зонами резко го просветления матрикса (рис. 1). Анализ характера альтерации МА в сократительных Кмц новорожденных показал, что общая доля митохондрий с необратимым повреждением и обратимым повреждением с явлениями перенапряжения была достоверно выше нормы и составляла (28,6 ± 6,3) % и (32,9 ± 6,7) % в ЛЖ и (27,1 ± 6,1) % и (34,2 ± 6,8) % в ПЖ соответственно. Ограниченное количество новообразованных органелл [(5,1 ± 1,8) % в ЛЖ и (6,4 ± 1,9) % в ПЖ] свидетельствовало об угнетении репродукции митохондрий и преобладании деструктивно-дегенеративных процессов в митохондриоме. Рис. 1. МА сократительного Кмц ПЖ сердца крысы экспериментальной группы на 1-е сутки постнатального онтогенеза. Электронограмма Следует отметить, что с 1-х по 3-и сутки после рождения повреждение МА усиливалось, альтерация была наиболее выражена на 3-и сутки в интрамуральной и субэпикардиальной зонах ЛЖ [3], ультраструктура орга-нелл характеризовалась полиморфностью изменений. Исследование органелл ПН локализации показало, что митохондрии в основном находились в состоянии умеренного отека, они свободно располагались в гиалоплазме вокруг ядра или местами образовывали скопления органелл, активно контактируя между собой. Вероятно, такая реакция ПН субпопуляции митохондрий связана с тем, что даже в условиях развития гипокси-чески-ишемических изменений [1] количество контактов в этой зоне клетки сохраняется на достаточном уровне для обеспечения слаженной, полноценной работы митохондрий, которые обеспечивают энергией общеклеточные процессы и механизмы, направленые на поддержание функционирования ядра. ММФ митохондрии имели разный размер, но практически все были в состоянии сильного отека, о чем свидетельствовало выраженное напряжение их внешних мембран (рис. 2). Деградация органелл преимущественно проявлялась в разрыве наружной мембраны и утечке матрикса в гиалоплазму. Количество разрушенных митохондрий было умеренным. Также отмечались признаки распада ассоциаций митохондрий. Изучение ССМ органелл показало, что процессы деградации в этой зоне клетки были значительно усилены и превалировали над процессами репродукции. Выпуск 4 (52). 2014 103 ІШТОрСЗ [ЩсШППЩІ Рис. 2. МА сократительного Кмц ЛЖ сердца крысы экспериментальной группы на 3-и сутки постнатального онтогенеза. Электронограмма Органеллы находились в состоянии выраженного отека, значительное количество митохондрий имели трещины и разрывы наружной мембраны, утрату матрикса, деструкцию крист. Наблюдалось большое количество лопнувших митохондрий, пустых и сморщенных органелл, в гиалоплазме присутствовали мелкодисперсные аморфные массы. Митохондрии практически не образовывали ассоциаций между собой. Высокоэнергетические митохондрии были наиболее подвержены повреждению, наименее чувствительными были низкоэнергетические органеллы. Перенапряжение или необратимая деструкция ортодоксальных форм высокоэнергетических митохондрий, вероятно, приводили к смещению динамического равновесия между конденсированными формами митохондрий и активной их трансформацией в ортодоксальные конфигурации. Несмотря на более значительное их накопление в пренатальном периоде, на третий день жизни эта субпопуляция органелл практически отсутствовала. Изучение количественного соотношения митохондрий с разной степенью альтерации в сократительных Кмц на 3-и сутки показало, что доля поврежденных орга-нелл прогрессивно увеличивалась и достоверно превышала норму, а неизмененные митохондрии обнаруживались в единичных случаях. Количество необратимо поврежденных митохондрий по сравнению с 1-ми сутками увеличилось на 61,9 % в ЛЖ, на 55,6 % в ПЖ. Их доля составляла (46,3 ± 6,8) % от всех митохондрий в ЛЖ и (42,1 ± 6,2) % в ПЖ. Обратимо поврежденных митохондрий также становилось больше - (48,1 ± 7,3) % в ЛЖ и (45,3 ± 7,1) % в ПЖ. Образования новых митохондрий практически не происходило, их доля оставалась на крайне низком уровне: в ЛЖ их количество составляло (3,2 ± 1,1) % [в норме (29,1 ± 2,7) %] и (5,3 ± 1,7) % в ПЖ [в норме (27,1 ± 2,6) %]. Анализ митохондрий Кмц экспериментальной группы на 7-е сутки показал, что на фоне измененных [(19,6 ± 5,2) % в ЛЖ и (15,2 ± 4,6) % в ПЖ] и разрушенных органелл [(14,7 ± 4,8) % в ЛЖ и (11,3 ± 3,2) % в ПЖ] (рис. 3) во всех зонах клетки осуществлялось возрастание доли небольших новообразованных митохондрий с плотным матриксом и плотно упакованными кристами (рис. 4). Органеллы располагались группами в зонах уплотнения гиалоплазмы под сарколеммой и между миофибриллами. Их доля превышала норму в два раза в ЛЖ и составляла (42,4 ± 4,7) %, несколько меньше в ПЖ в 1,7 раза [(29,7 ± 4,4) %]. Количество неизмененных митохондрий постепенно увеличивалось, но их было все еще в три раза меньше по сравнению с нормой в ЛЖ и в два раза меньше - в ПЖ; преимущественно они были представлены низкоэнергетическими органел-лами. Анализ количественного соотношения различных типов митохондрий в экспериментальной группе на 7-й день показал сдвиг в сторону популяции низкоэнергетических митохондрий, причем конденсированных высокоэнергетических митохондрий было крайне мало, хотя их количество становилось несколько выше, чем на 3-й день [(0,8 ± 0,4) % в ЛЖ и (1,9 ± 0,4) в ПЖ]. Рис. 3. МА сократительного Кмц ЛЖ сердца крысы экспериментальной группы на 7-е сутки постнатального онтогенеза. Электронограмма Рис. 4. МА сократительного Кмц ЛЖ сердца крысы экспериментальной группы на 7-е сутки постнатального онтогенеза. Электронограмма На 14-е сутки в экспериментальной группе процессы объединения митохондрий в единую систему 104 Выпуск 4 (52). 2014 продолжались. Изучение количественного соотношения митохондрий с различной степенью повреждения и новообразованных органелл показало, что процессы репродукции на этом сроке развития значительно превалировали над процессами деградации, особенно в ЛЖ [(37,5 ± 5,2) % новообразованных органелл; в норме (16,3 ± 2,4 %)]. Новообразованные митохондрии были относительно небольшого размера с умеренной плотностью матрикса и крист. В ПЖ активность образования митохондрий была несколько ниже: здесь доля новообразованных митохондрий составляла (28,6 ± 4,3) % [в норме (15,1 ± 2,2) %]. Количество неизмененных митохондрий прогрессивно увеличивалось, но их было все еще меньше, чем в контрольной группе на этом сроке развития. Органеллы были относительно большими, с умеренно развитыми кристами и прозрачным матриксом, среди них нередко обнаруживались митохондрии с явлениями отека и вакуолизации, перенапряжения (рис. 5). Суммарное количество необратимо и обратимо поврежденных митохондрий в ЛЖ составляло 28,9 %, в ПЖ 21,5 %. Репродукция осуществлялась путем образования преимущественно низкоэнергетических органелл, в отличие от миокарда контрольных животных, где накопление митохондрий проходило за счет популяции высокоэнергетических форм. Это свидетельствовало об относительно неэффективном режиме функционирования митохондрий в группе крыс, которые развивались в условиях внутриутробной гипоксии в пренатальном периоде. В данной группе среди высокоэнергетических органелл встречались их конденсированные формы, хотя их количество было незначительным. Рис. 5. МА сократительного Кмц ПЖ сердца крысы экспериментальной группы на 14-е сутки постнатального онтогенеза. Электронограмма С 7-х по 30-е сутки процессы накопления митохондрий активно продолжались. Изучение соотношения различных типов митохондрий на 30-е сутки в экспериментальной группе показало интенсивную репродукцию низкоэнергетических митохондрий, доля которых в ЛЖ составляла (31,8 ± 2,5) % [в норме (15,4 ± 0,9) %], в ПЖ (27,4 ± 1,8) % [в норме (19,1 ± 1,2) %]. На фоне этого доля высокоэнергетических митохондрий постепенно увеличивалась, причем количество конденсированных высокоэнергетических митохондрий значительно возрастало. Анализ митохондрий зрелого миокарда сократительных Кмц ПЖ и ЛЖ не выявил достоверных различий между экспериментальной и контрольной группами. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 1. На 20-е сутки в Кмц интрамуральной зоны ПЖ доля необратимо поврежденных митохондрий составляет (26,6 ± 4,9) %, обратимо поврежденных с признаками перенапряжения - (47,2 ± 6,2) %, новообразованных - (17,9 ± 2,1) % митохондрий, неизмененных - (8,3 ± 2,5) %, что достоверно отличается от значений нормы. Реакции митохондрий характеризуются умеренной деструкцией и перенапряжением высокоэнергетических органелл преимущественно ССМ локализации, угнетением процессов образования митохондрий в Кмц, увеличением популяции конденсированных форм высокоэнергетических митохондрий в ММФ зоне, увеличением уровня ассоциативности в ПН и ММФ зонах клетки, отражая активную адаптивную реакцию на гипоксию. 2. Альтерация МА наиболее выражена на 3-и сутки в интрамуральной и субэпикардиальной зонах ЛЖ, где доля необратимо поврежденных митохондрий составляет (46,3 ± 6,8) %, обратимо поврежденных и с явлениями перенапряжения - (48,1 ± 7,3) %, что статистически весомо превышает показатели контрольной группы, а уровень новообразованных и неизмененных митохондрий достоверно ниже нормы и составляет соответственно (3,2 ± 1,1) % и (2,4 ± 0,9) %. С 7-х суток и в течение одного месяца происходит активизация адаптивных механизмов путем репродукции и активного накопления низкоэнергетических форм митохондрий, что приводит к относительно неэффективному режиму функционирования МА. 3. Гетерогенитет органелл обусловливает специфический ответ митохондрий на гипоксию. Наиболее чувствительны к ней высокоэнергетические митохондрии, наименее чувствительны - низкоэнергетические. Перенапряжение или необратимая деструкция ортодоксальных форм высокоэнергетических митохондрий приводят к смещению динамического равновесия с конденсированными формами митохондрий и активной трансформацией последних в ортодоксальные конфигурации, что отражает степень компенсации гипокси-ческого повреждения. Напротив, увеличение доли конденсированных форм является проявлением активного адаптивного процесса. Истощение резерва конденсированных высокоэнергетических митохондрий на фоне деструкции ортодоксальных органелл, повреждения комплексов низкоэнергетических митохондрий и низкая репродукция органелл характеризуют дезадаптив-ное состояние в клетке.

About the authors

M. V. Ivanchenko

I. V. Tverdokhleb

Email: ivt@dsma.dp.ua

References

Supplementary files